水蒸气蒸馏法提取杨梅叶精油的优化.doc

GC-O和GC-MS结合鉴定杨梅叶精油中的关键香气成分尹洁，蒋健，杨君*，胡安福，黄芳芳(浙江中烟工业有限责任公司，浙江杭州 310024)摘要：采用3种提取方法提取杨梅叶精油，将其添加入卷烟中评吸评价，评价最好的为水蒸气蒸馏法提取出的杨梅叶精油采用水蒸气蒸馏法提取杨梅叶精油，并用气相色谱-质谱联用结合嗅辩仪分析检测杨梅叶精油成分和主要香味物质共检测出84种物质，烯烃类物质46种，醇类物质16种，酮类物质8种，醛类物质5种，酯类物质4种，酸类物质1种，酚类物质1种，烷烃物质1种和酰类物质1种，其中β-石竹烯（40.16%）和α-葎草烯（28.023%）含量最高检测出46种香味成分，综合分析表明β-石竹烯、α-白菖考烯、氧化石竹烯和α-葎草烯是杨梅叶精油的关键特征香味成分关键词：杨梅叶精油；香气成分；气质联用仪-嗅闻技术Characterization of Volatile Constitutes and Odorous Compounds in Myric rubra leaves Oil by GC-MS and GC-OYinjie, Jiangjian, Yangjun*, Huanfu, Huangfangfang(China tobacco zhejiang industrial.co., ltd., Hangzhou 310008, Zhejiang, China)Abstract: Three kinds of extraction methods were used to extract the essential oil from Myrica rubra leaves. Myric rubra leaves oil was added to cigarettes and the cigarettes were evaluated. The best extract was the essential oil extracted by the steaming method. The Myric rubra leaves oil was extracted by steam distillation and the volatile constitutes in essential oil of Myric rubra leaves was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). 84 compounds in the oil were identified, 46 kinds of Olefin substances, 16 kinds of alcohols, 8 kinds of ketones, 5 kinds of aldehydes, 4 kinds of esters, one kind of acids, one kind of phenols, one kind of hydrocarbons and one kind of acid substances substances, and in which β-Caryophyllene (40.16%) and α-Humulene (28.023%) were the main compounds. Odorous compounds in essential oil of Myric rubra leaves was analyzed and demonstrated by gas chromatography-mass spectrometry and gas chromatography-olfactometry (GC-MS/O), and 46 kinds of Odorous compounds were analyzed. The results demonstrated that β-Caryophyllene、α-Calacorene、Caryophyllene oxide andα-Humulene were the key contributors to the characteristic aroma of finger citrus oil. Keyword: Myric rubra leaves oil; odorous compounds; GC-MS/O杨梅(Myrica rubra ) 属杨梅科(Myricaceae)，原产于中国的亚热带，世界上有60多种，中国有6种[1]。

杨梅叶，中药名，为杨梅科植物杨梅的叶，分布于江苏、浙江、江西、福建、台湾、湖南、广东、广西、四川、贵州、云南等地具有燥湿祛风，止痒之功效，常用于皮肤湿疹杨梅枝叶和根皮在中国大陆、台湾地区和日本等地常用作收敛剂、解毒剂和肠胃止泻剂等传统中药成分[2]作为名贵珍果具有良好的药理作用，祖国传统医学对它亦有很高的评价有关杨梅叶所含的挥发性芳香精油的成分分析鉴定多采用气相色谱- 质谱(GC-MS )联用技术，刘宁等[3] 采用水蒸气蒸馏法提取矮杨梅叶挥发油，用GC-MS 法分析鉴定；钟瑞敏等[4] 采用气相色谱- 质谱联用技术并结合Kovats保留指数(IK )对比法分析鉴定了乌杨梅(Myrica rubra Var. astropurea Tsen. )鲜叶芳香精油的成分；王贤亲等[5] 采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术对丁岙杨梅叶的挥发油化学成分进行分析，共分离鉴定出17 种化合物，占挥发油总量的80 ％以上；马惠芬等[6] 采用同时蒸馏萃取法(SDE)提取杨梅叶挥发油化学成分，利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用方法进行分析，从杨梅叶中分离出51 个色谱峰，鉴定出40 种化合物气相色谱- 嗅觉测量方法(GC-O)是一种直观的感官检测方法，即通过人的鼻子直接嗅闻复杂的混合气味从而筛选出具气味的化合物，并对气味特征进行评价。

GC-O 可以发现食品中大量挥发性成分中真正具有气味活性的成分和各气味成分在不同浓度下对整体气味的贡献，在鉴别特征香味化合物、香味活性化合物等方面具有明显的优势随着技术的发展和成熟，GC-O 技术目前已广泛地应用于食品风味的研究当中，如Xie 等[7]采用GC-O 法分析了中国传统培根肉的风味物质；Lin 等[8]采用GC-O 鉴别冻压葡萄柚籽油中的挥发性物质；Jezussek 等[9]采用GC-O 鉴定棕米的特征风味物质；Qian 等[10]采用GC-O 研究奶酪的香味化合物；马永昆等[11]利用GC-O 法分析了天然苹果香精的关键香气成分综上所述，气相色谱- 嗅觉测量方法(GC-O)在食品和天然产物香味分析领域应用广泛，但杨梅叶精油的活性香气成分系统分析及其加香应用研究未见报道，本实验采用气- 质联用结合气相色谱- 嗅闻技术，分析鉴定杨梅叶精油中的活性香气成分，建立杨梅叶精油香气物质分析研究方法，并探索研究其在烟草领域的应用价值，旨在为系统开发杨梅植物源在更广阔香味领域的应用提供依据1 材料与方法1.1 材料与试剂原料：东魁杨梅叶，采自浙江仙居试剂：硫酸钠、甲醇和乙醇(AR，北京化工厂)、二氯甲烷（色谱纯，TEDIA Company, Inc.公司）等。

乙醇为分析纯，蒸馏水1.2 仪器与设备气相色谱-质谱联用仪Agilent 7890/5975（美国安捷伦），油浴锅（浙江纳德科学仪器有限公司），挥发油提取仪（天宫玻璃仪器厂），同时蒸馏萃取（Simultaneous-distextraction，SDE)装置（天宫玻璃仪器厂），旋转蒸发仪（瑞士Buchi布奇公司），Sniffer9000嗅辨仪（瑞士Brechbühler 公司）1.3分析方法1.2.1杨梅叶精油的提取(1)水蒸气蒸馏法提取杨梅叶精油称取一份杨梅叶2000g，用少量水润湿，进行水蒸气蒸馏，采用1:6的料水比，170℃保持微沸约6小时，用挥发油测定仪收集挥发油，得到有特殊香气的透明油状液体参照《中华人民共和国药典》2000年版一部(附录XD)2)同时蒸馏萃取法提取杨梅叶精油取风干杨梅叶，用粉碎机粉碎，过筛以料水比1:5混合，将混合物放置到1000mL圆底烧瓶中，将该圆底烧瓶放置于同时蒸馏萃取（Simultaneous-distextraction，SDE)装置的轻相侧（电热套），调节温度至120±5℃，加热至样液沸腾取50mL二氯甲烷于200mL圆底烧瓶中，将该圆底烧瓶放置于SDE装置的重相侧（水浴锅），调节温度至48±2℃，加热萃取液至沸腾。

连续提取2h后，取下萃取液，将萃取液用无水硫酸钠干燥过夜，过滤滤液用旋转蒸发仪去除有机溶剂，得到精油产物3)超临界CO2萃取法提取杨梅叶精油取风干杨梅叶，用粉碎机粉碎，过筛将样品放置于萃取斧，接通二氧化碳气瓶，加压，设置压力为30MPa，萃取温度为40℃，静态萃取1h上述步骤完成后，换为动态萃取1h，设置分离斧压力5MPa，萃取温度70℃，得到杨梅叶精油4)卷烟加香评吸于温度22±1℃和相对湿度（RH）60±2%条件下平衡待加样烟丝48h将平衡好的烟丝平均分成四组，取不同方法提取的杨梅叶精油，吸取按烟丝质量0.005‰计算的杨梅叶精油，稀释于5 mL 95%乙醇中，以加相同量的纯水为空白对照，用喉头喷雾器均匀的喷洒在试样烟丝上，将四组烟丝共同在相同条件下平衡48h用填烟器四组烟丝制成烟支，并于相同条件下再平衡48h后，进行感官评吸专家小组评吸1.2.2杨梅叶精油的制备与保存将收集的精油(含少量水)加入适量的无水硫酸钠进行脱水将制备的挥发油置于棕色密封瓶中，于4℃下保存备用1.2.3杨梅叶精油的气相色谱-质谱分析色谱条件：DB-5(0.25mm×30m×0.25 μm)毛细管柱，不分流，进样量1.0μl，进样温度280℃，四极杆温度150℃，载气He，流量1.0 ml/min。

程序升温：85℃保持1min，1℃/min升到160℃,保留1min,30℃/min升到80℃,保持10min.质谱条件：EI-MS，离子源温度230℃，电子能量70eV，质量范围50~500u，用NIST2.0谱库检索加以确认定性分析：采用仪器自带的图库进行谱图检索，并检索自己本实验室平台建立的图库，结合相关文献定性定量分析：用面积归一化法进行定量分析，获得单一物质的相对含量1.2.4杨梅叶精油的气相色谱-嗅闻分析GC-O分析条件：GC-O系统由气相色谱（配FID检测器）和Sniffer嗅辨仪组成气相条件： DB-1色谱柱（30 m*0.25 mm*0.25 μm），分流比2:1，进样量1.0 μL，进样温度220 ℃，载气为高纯氦气，浓度大于99.999%，流量1.0 mL/min程序升温条件同GC-MS气相毛细管柱末端以分流比为1:1分别连接FID检测器和Sniffer嗅辨仪GC柱箱与嗅辨仪传输线温度220 ℃，在嗅觉端口处对气体进行加湿，防止因气体干燥引起嗅辨师不适采用稀释法和强度法对供测样品进行香味物质的闻香分析嗅闻人员在实验过程中对其鼻子闻到的气味进行详细描述，并定义其气味强度值，此为强度法。

供测样品逐级稀释（例如稀释5、10、50、100、200倍等），直到嗅闻人员闻不到气味为止，每种香味物质最高稀释倍数即为FD值，此为稀释法2 结果与分析2.1杨梅叶精油提取方法的选择及在卷烟中的加香应用研究不同提取方法提取杨梅叶精油的卷烟加香评吸：三种方法提取挥发油均为淡黄色，澄清透明，无刺激性，具浓郁的杨梅叶特有味道水蒸气蒸馏杨梅叶精油具有浓郁的青木香，果香明显，并伴有较轻的青滋感、醛香和轻微甜香，嗅闻香味较另外两种提取方式甜润感更足，清香突出对利用水蒸气蒸馏法、同时蒸馏萃取法。