注射用重组双功能水蛭素产品质量研究.doc

注射用重组双功能水蛭素产品质量研究　　张艳玲，莫炜Δ，王龙生，杨新英，宋后燕【摘要】本实验室构建了分泌型高效表达重组双功能水蛭素(RGD-Hirudin)的工程酵母，经发酵、纯化，获得重组双功能水蛭素纯品，其原液经质量分析，符合国家静脉注射用药的标准，可以用于制备静脉注射用粉针剂关键词】注射用重组双功能水蛭素；质量研究【Abstrat】Theexpressinplasid，HD-pPI9K，asntrutedbyinsertingDNAfRGD-hirudfin(RGD-Hirudin)inyeastexpressinvetrpPI9K.Thislneasferentedfr3days，andthepurifiedRGD-Hirudinasgainedafterpurifiatin.Qualityanalyseseretested.TheRGD-Hirudinaseasureduptstandardfinjetin.天然水蛭素是凝血酶的特异抑制剂，从医用水蛭的唾液腺中提取而得，可与凝血酶形成摩尔比为1:1的非共价相结合的可逆复合物，对凝血酶有很高的亲和力，使凝血酶失去裂解纤维蛋白原的才能，抑制纤维蛋白的形成，因此，低浓度的水蛭素可有效地抑制血液凝固［1］。

我们在保存天然水蛭素原有的生物学作用的根底上，将RGD编码顺序交融在天然水蛭素DNA基因中［2～5］构建了含RGD编码顺序的水蛭素DNA克隆HD-pPI9K，表达质粒转化毕赤酵母后，经挑选获得高表达菌株，并建立工程菌株，实现了高效、分泌型表达(另文发表)本文重点报道重组双功能水蛭素原液的质量研究1材料与方法1.1抗凝比活性测定1.1.1试剂的配制0.5%纤维蛋白原：纤维蛋白原(上海莱士血制品)0.5g，以100l生理盐水溶解凝血酶：中国生物制品检定所制备的凝血酶，按照标示量，用生理盐水复溶后成100NIU/l阴性对照：以生理盐水为样品，凝血酶参加后立即凝固标准对照：德国Hhest公司消费的Refludan，按照其标示活性溶解分装成1600ATU/支(即0.1g/支)，冻干，详细操作步骤按说明书进展1.1.2方法凝血酶滴定法［1］(所有过程在37℃水浴中操作)1.1.3抗凝活性计算抗凝活性(ATU/l)=(n-1)×100×稀释倍数，n为添加凝血酶的次数，1为扣除本底1次(即最后一次参加凝血酶，纤维蛋白原凝固)，100为凝血酶活性单位100NIU/l，稀释倍数为所测定样品的稀释倍数1.1.4蛋白含量测定按改进Lry法进展［6］。

1.1.5抗凝比活性抗凝比活性(ATU/g)＝单位抗凝活性(ATU/l)/单位蛋白含量(g/l)1.2抗血小板聚集比活性测定［7］1.2.1试剂的配制ADP：Siga公司，用生理盐水溶解并稀释，配成400μl/L贮存液，-20℃保存1.2.2血小板来源正常志愿者1.2.3仪器血小板聚集仪(上海斯隆医电设备)1.2.4方法按说明书操作1.2.5结果断定血小板聚集抑制率：以未用药测得的血小板聚集率作为空白对照，体外给药后，测得的血小板聚集率除以空白对照所得的比值为相对聚集率，此相对聚集率与1的差值即血小板聚集抑制率血小板聚集抑制率＝1－(用药后测得的血小板聚集率/空白对照)1.3纯度测定高效液相色谱法(HPL)［6］色谱主机：SHIAZU，L-10AD；色谱柱：DELTAPAK18-300A，3.9×15；流动相：A：水+0.1%TFA；流动相：B：90%乙腈+0.1%TFA；梯度：100in内，流动相B从0%到100%；流速：0.2l/in；样品浓度：1g/l；上样量：20μl；检测波长：280n1.4肽图分析TPK处理的胰蛋白酶酶解RGD-Hirudin样品和理化对照品，分别以8柱反相层析柱，0.1%TFA-H2/0.1%TFA-乙腈为流动相，214n波长检测，并用质谱测定各肽段分子量，计算总分子量［6］。

1.5紫外光谱扫描在200～400n波长范围内扫描RGD-Hirudin样品和理化对照品［6］1.6残留工程菌蛋白含量测定1.6.1Pihia酵母全菌蛋白制备Pihia酵母在YPD培养基中30℃培养，菌体超声波/机械破碎，得蛋白初提物水溶液，Lry法定量1.6.2抗Pihia酵母全菌蛋白多克隆抗体制备免疫动物：新西兰大白兔(2.5kg，雄性)；免疫蛋白：上述Pihia酵母全菌蛋白(20g/只)，体积比1:1与完全福氏佐剂混合免疫方法：背部皮下多点注射(1l/点)，每周1次多抗滴度：免疫4周后，取血，别离血清，双扩散法测定其效价，假设高于1:16，即颈动脉放血，别离血清(抗酵母全菌蛋白多抗)；假设低于1:16，那么继续按上述方法免疫动物，直至效价高于1:16为止1.6.3残留工程菌蛋白含量测定(ELISA)Pihia酵母全菌蛋白系列浓度：100ng/l、80ng/l、60ng/l、40ng/l、20ng/l、10ng/l、5ng/l、0ng/l样品：1g/l一抗：即自制抗Pihia酵母全菌蛋白多克隆抗体，稀释度为1:100二抗：华美试剂公司，羊抗兔IgG-HRP，稀释度为1:1000显色方法：邻苯二胺/H22/pH5柠檬酸缓冲液。

比色方法：测定波长：492n，参比波长：655n2结果2.1抗凝比活性见表1　　表1原液抗凝血酶活性测定(ATU/l)　　样品蛋白含量经改进Lry法测定，为24.40g/l；样品抗凝比活性10，300ATU/g，＞10，000ATU/g2.2抗血小板聚集比活性蛋白含量测定结果见表2，图1　　表2原液抗血小板聚集活性测定结果　　图1血小板聚集抑制率曲线　　0.1g/l原液(体外给药)对血小板聚集抑制率≥10%，随着剂量的加大，可以看到显著的量效关系2.3纯度测定结果(HPL)见图2样品的HPL纯度为96.64%，＞95%，符合静脉注射的国家标准　　图2高效液相色谱图　　2.4肽图分析结果见图3图3中显示：四个峰，即组分842.5100、1119.5825、2187.8209、2818.0970为RGD-Hirudin经TPK处理的胰蛋白酶消化后，所得的4个片段，与理论计算一致它们的分子量总和与RGD-Hirudin的分子量一致　　图3质量肽图图谱　　2.5紫外光谱扫描见图4样品的特征吸收波长在271.2n　　图4紫外吸收光谱图　　2.6宿主菌蛋白残留量测定结果(ELISA)宿主菌蛋白残留量为0.0022%。

3讨论药品的质量控制是一项非常重要的工作，特别对于新药，质量控制尤为重要对于不同用药途径的药品，质量要求也不一样，静脉注射用药的质量要求最高检定的工程有纯度分析，比活性分析等12项原液质量检定，本文总结了涉及静脉注射用药最为关键的质量指标的研究我们教研室已经完成了重组双功能水蛭素的中试研究和临床前研究，产品的质量控制是其中最重要的研究内容，经过以上所有工程测定，重组双功能水蛭素符合国家静脉注射用药的质量标准，获得了国家一类生物技术新药临床试用批件测定Hirudin抑制凝血酶活性的方法主要是凝血酶滴定法，其精细度为100ATURGD-Hirudin的抗凝比活性≥10000ATU/g我们研制的RGD-Hirudin是一种双功能的水蛭素，具有抗凝和抗血小板聚集双重功能，因此，我们建立了测定双重活性的规程，我们采用凝血酶滴定法测定其抗凝活性根据文献报道，阻断血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa复合物的抗血小板药的最简便的测定其抗血小板聚集的方法为比浊法由于这类药对于抑制二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集效果最好，因此，本法采用比浊法测定ADP诱导的血小板聚集，观察不同给药剂量下的血小板聚集率的变化，以反响RGD-Hirudin的抗血小板聚集比活性。

由于血小板聚集试验受外界各种因素的影响，变异较大，本法采用半定量的方法测定其抗血小板活性［7］注射用重组双功能水蛭素的最终成品是一个混合物，组分中含分子量为7030Da的RGD-Hirudin(30±10)%和分子量为7180Da的RGD-Hirudin(70±10)%，两者总和＞95%［2］质量肽图和紫外吸收光谱的测定是进一步对注射用重组双功能水蛭素构造确实证，证明RGD-Hirudin是蛋白质/多肽类药物外源性残留物含量的测定包括工程菌菌体残留蛋白和残留DNA的测定，其中残留蛋白含量采用ELISA定量；残留DNA含量采用SuthernBltting斑点杂交的方法定量(另文发表)［8］　　【参考文献】　　1arkardtF，SturzebekerJ，GriessbahU.Hirudinasaninhibitrfthrbin.ethdinEnzylgy，1970，19:924-932.2张艳玲.毕赤酵母羧肽酶对重组双功能水蛭素端的降解作用.中华中西医杂志，2022，6(18):2441-2443.3diNB，BaughanSA，PaashBD，etal.PharakinetisandpharadynaisfTP-9201，aGPⅡbⅢaantagnist，inratsanddgs.JardivasPharal，1995，25:888-897.4hangJY.Thefuntinaldainfhirudin，athrbin-speifiinhibitr.FEBSLett，1983，164:307-313.5SithJ，TahiasK，adisnEL.PrtEinlpgraftingtnstrutavariantftissue-typeplasingenativatrthatbindsplateletintegrinaⅡbB3.JBihe，1995，270:30486-30490.6药典委员会.中华人民共和国药典(三部).北京：化学工业出版社，2022，附录16-17.7diNB，BaughanSA，PaashBD，etal.PharakinetisandpharadynaisfTP-9201，aGPⅡbⅢaantagnist，inratsanddgs.JardivasPharal，1995，25:888-897.8蔡旭.地高辛标记探针检测重组双功能水蛭素中残留DNA的含量.药物生物技术，2022，11(6):392-394.。