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接近遗传密码符号扩增的生物合成方法：非自然DNA碱基对的分子设计1.简介2010年, Craig Venter's 团队报道了一种新兴的含有一个人工合成具有1.08 M 碱基基因组的支原体细菌1这个成就是化学家和生物学家协作努力通过五年研究出来的结果初始细胞的生成需要很大的努力，一旦制得人工细胞，他们就会像自然细胞一样增殖因此，人工设计的细胞可以合理的成本再生，用作合成有用蛋白质和其他材料的生物工厂现有的生物系统的重复设计是一个合成生物学途径的例子2 另一合成生物学方法的类型是构建一个新的生物系统，用最新的生物组分来建造在这个方法中，新的人造组分用于开发服务于某个目标，在生物系统中他们与侧边的自然组分一起运作新的组分由重复的“proof of concept”试验创建原型组分基于某个概念或者主意设计，并根据物理和生物实验结果进行改进在这里，我们通过对DNA遗传密码符号扩展的非自然碱基对的创建，描述这种类型的生物合成方法3-82. 非自然碱基对的发展地球生命遗传信息在DNA序列中有四个不同碱基对编码，腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G), 胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)DNA双链分子中，A选择性的与T配对，G与C配对。

碱基配对原则是基本的通过复制、转录和翻译的遗传信息流因此，DNA中引入一个人为创建的碱基对可以增加遗传字母，扩大遗传信息，提供一个新的生物技术能够与特定的新组分结合为核酸和蛋白质(Figure 1)9此外，最近的利用人工碱基在复制和转录方面的研究已经显示出新的分子相互作用和生物反应机理，仅仅通过自然组分利用生物分子标准进行馋鬼分子观测不出来而且，人为的提高生物系统遗传密码符号对于化学家来说是一个巨大的挑战最重要的问题是，费自然碱基对(X-Y) 作为三分之一的碱基对具有很高的特有的选择性，也就是说，X选择性与Y配对，与此同时, A-T和G-C在生物系统中配对(Figure 2)在复制中，DNA聚合酶结合底物与模板链之间部分双链DNA片段随后，5'-三磷酸何干(dNTP, substrate)进入DNA聚合酶络合物当基质在模板中与正确的伙伴配对，然后引物3'-羟基基团的氧原子进攻基板三磷酸α 位置这个结果导致在引物和导入物之间形成磷酸双酯键，并且释放出焦磷酸做为一个离去集团引物结合正确的基质后，DNA聚合酶滑向模板DNA 链，下一个基质结合发生复制中自然碱基配对的选择性非常的高例如，大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段,10,000 次结合会出现一次不正确的结合，10也就是说克列诺片段每一次复制的自然碱基对选择性为99.99%。

3. 自然碱基对: A-T和G-C 创建一个非自然碱基对，我们需要了解为什么A-T 和G-C 碱基对按照他们的化学、物理、生物状态在复制中有如此高的选择性在A-T和G-C 配对中，嘌呤碱基(A or G)与嘧啶碱基(T or C)配对, 两个氢键用于A-T，三个用于G-C (Figure 3)因此，每一个碱基对糖苷键的距离约为10.7-11.0 Å，并且双螺旋DNA 分子具有规则的人字齿轮结构氢键在质子予体残基和质子受体原子或残基中间形成A-T和G-C对之间，氢键模式各不相同，因此，A 与T, G 和C配对总是一种常规的螺旋结构然而，最近的研究已经表明, 在复制中氢键的形成没有必要搭配正确的碱基对1995年，Eric Kool 和他的同事们设计合成了一个疏水性非自然Z–F对，其中Z和F 的形状分别模仿A 和T(Figure 4)11-13 对于Z，A 中1- 和3-氮被碳替代，6-氨基被甲基替代对于F，T中3-氨基被C-H替代，2-和4-酮基由氟原子替代通常，一个氟原子质子受体的能力低于酮十倍Kool团队化学方法合成特定位置中含有Z 或F的 DNA 模板 ，以及他们的核苷三磷酸盐(dZTP和dFTP)，作为底物在体外进行复制实验。

他们表明，大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段在模板中有效的结合了dFTP 和dTTP 成为DNA ，对立与Z 或A，也与dZTP 、dATP 对立与F或T合并相比之下，dCTP 相对Z 和 dGTP相对F的合并效率较低因此，疏水性非自然Z-F对在复制中作用，与A-T对兼容，这表明，复制中配对碱基之间形状互补性重要于氢键互补性14通过聚合酶来识别，A 和G中的3-氮, C和T中的2-酮作为氢键受体对于小沟是很必要的，在聚合酶中与具体的氨基酸残基相互作用(Figure 3)15例如，缺失2-酮基的嘧啶类似物基质在PCR中不能够并入DNA ( P olymerase C hain R eaction).16 Kool的Z碱基相对于嘌呤3-氮缺少氢键受体原子，因此，他们新近研发Q 碱基，其位置上有一个氮(Figure 4)17克列诺片段被复制的Q-F碱基对比Z- F对更高效其他的因素，比如基质疏水性，基质偶极距，相邻级之间堆积相互作用，以及CH- π相互作用18，在复制中对于碱基对选择性也很重要考虑到这些，目前为止非自然碱基对的各种类型已经发展至此下面的季节中么，我们将介绍具有代表性的非自然碱基对以及他们的发展进程。

4.Benner团队的亲水性非自然碱基对在1980年代后期，Steven Benner和他的同事们报道了四种类型的具有不同氢键几何体的 非自然碱基对，这不同于A-T和G-C对19, 20 其中一个典型代表就是6-氨基-2-ketopurine (isoG)和2-氨基-4-ketopyrimidine (isoC)间的碱基对，他们分别是G和C的结构异构体(Figure 5)19Benner团队证实了isoG-isoC对通过克列诺片段在复制中互补作用此外，isoG基质(isoGTP)并入RNA 相对于isoC 并入DNA 模板，通过T7 RNA聚合酶21 此外，1992年，isoG-isoC对用于体外翻译系统，通过一个短的化学合成mRNA(含isoC)和一个3-iodotyrosyl tRNA (含isoG) ,使得不标准氨基酸特定合并成为多肽22Benner团队这些开创性的研究对利用非自然碱基对的遗传膨胀系数受到了很大的关注然而，这些非自然碱基对仍有很多的缺点比如，isoG碱基溶液中经受keto-enol互变异构化，isoG碱基与T烯醇化(Figure 5)21 除了isoG的问题，isoC中的2-氨基,相当于自然碱基的2-keto位置，降低与聚合酶的相互作用。

21此外，isoC的核苷在水溶液中不稳定，室温下，四天以后水中中性环境下会有50% 的isoC核苷三磷酸分解掉23尽管在isoC碱基位置3处(相当于自然嘧啶碱基位置5处)引入甲基可以改良其稳定性，然而 甲基-isoC 核糖核苷仍然易受其β-糖苷键差向异构化作用，从β-转换为α-形式最近，Benner团队通过在位置3处引入一个硝基解决了这个问题,24 如下所示2005年, Benner团队通过利用一个改性的T 碱基，2-thiothymine (TS),替代T (Figure 5), 解决了isoG keto-烯醇互变异构化的难题，用于isoG-isoC碱基对系统25 TS中大尺寸的硫原子阻止了isoG形式中与烯醇的配对, 但仍是没有空间斥力的配对这个策略类似于Kool的配对碱基键形状适合概念，以及Harry 1988年报道的的非自然碱基对的概念，26 他利用一个改良的鸟嘌呤，6-thioguanine作为一个新的碱基非自然isoG-isoC对与A-TS对在酶聚合链反应中共同作用：isoG-isoC对的每一次复制选择性达到98%，而isoG-isoC选择性在没有TS的帮助下每次复制达到93%。

25然而，98%非自然碱基对选择性对于复制来说是不够的，并且非自然碱基对的保留率在PCR反应扩大DNA 片段的20周期中变为67% (0.9820 =0.67)因此，对于复制中非自然碱基对的实际使用中，每一次复制超过99% 的选择性是必要的2007年，Benner团队改进了非自然碱基对系统，并研发了P-Z 对，其在PCR扩增中不需使用A-TS对(Figure 5)24 不同于isoG，P碱基在溶液中不经历不良的互变异构化Z碱基中的硝基基团由于其亚氨基的去质子化，阻止了它的核苷衍生物的差向异构化虽然P-Z对选择性当时在PCR中为97.5% ，但是最近的报道表明优化PCR 条件下改良的选择性在99.8%275. Romesberg团队的疏水性非自然碱基对Kool的关于非氢键碱基对的开创性实验引发疏水性碱基对作为非自然碱基对的候选物Floyd Romesberg和他的同事开发了大量的疏水性非自然碱基对，在复制系统中检测他们的能力1999年，他们报道了一个疏水性异喹啉衍生物PICS(Figure 6)，其自我互补碱基对在双螺旋DNA 片段中具有很高的热稳定性28此外，PICS酶作用物与DNA酶结合通过克列诺片段与PICS在模板中相对应。

不幸的是，在PICS 基板中参入PICS后，引物暂停延伸这是因为PICS-PICS对的形状对于常规DNA双螺旋的空间来说太大了，其PICS 碱基相互堆叠，不允许聚合酶识别因此，他们详尽的设计和合成了另外的疏水性非自然碱基对，并在复制中检验了它们的能力29-352009年，他们成功的开发了疏水性非自然碱基对5SCIS-MMO2和5SCIS-NaM (Figure 6)，他们的功能是作PCR扩增中三分之一的碱基对36, 37与之前的PICS–PICS对相比， 这些碱基对的空间互补形状有所改进5SCIS–NaM 对在PCR中最佳的保真度达到99.8%，尽管它取决于周围非自然碱基对的排列顺序这些疏水性碱基对通过T7 RNA 聚合酶在转录中也起作用38 该团队还通过一个进化工程技术设计出DNA聚合酶，通过采用突变聚合酶了解决复制中使用PICS-PICS 碱基对时聚合酶暂定问题396. Hirao团队的一系列非自然碱基对我们团队在1997年之后也研究了非自然碱基对大量的“proof of concept”实验后，我们于201年开发出第一个非自然碱基，在2-氨基-6-dimethylaminopurine (x)和2-oxopyridine (y)之间(Figure 7)。

40这个x-y设计包含两个概念：Benner氢键模式(它不同于自然碱基对’s)和一个位阻效应这个x-y对具有两个氢键，x 的2-aminopurine 部分通过一个类似的氢键作用与T 配对因此，我们在x的6位置处添加一个巨大的二甲胺基团, 通过T中6-dimethylamino 基团和4-keto基团之间的空间位阻来排除x-T配对与 T相反, y 具有一个氢键代替了keto 基x-y 对功能在转录中具有很高的选择性，T7RNA聚合酶混合y三磷酸基质(yTP) 成为RNA,相对于x 在DNA模板中，具有高于95%的选择性此外，我们通过用一个噻吩基替代二甲胺基改进了非自然碱基对的形状互补性因此，我们开发了2-amino-6-thienylpurine (s)作为y的配对搭档 (Figure 7)41噻吩基的平面化比X二甲胺基更加有效的排除了与T 的错误配对此外，平面性增加了s 碱基与相邻碱基在DNA 链中叠加的能力相比x-y 对，s-y对在转录中的选择性和效率都有了很大的改进 不仅仅yTP 也包括yTPs的一些部分，通过T7 RNA聚合酶，比如biotin-和fluorophore-linked y 碱基，与RNA结合,相对应于DNA模板中。

42-442002年，通过结合特定的含有s–y对和一个E. coli体外翻译系统的转录，我们成功的特定结合一个非标准氨基酸，3-chlorotyrosine变为一个蛋白质41 因此，s–y对可疑作。