乙偶姻代谢.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑乙偶姻代谢 细菌中乙偶姻代谢相关研究 第一章 前 言 1.1 乙偶姻的根本性质及其应用 1.1.1 乙偶姻的性质 乙偶姻（acetoin）即3-羟基丁酮，分子量88.12，有两种手性异构体乙偶姻单体为无色或淡黄色液体，有奶油香气，两分子乙偶姻易聚合成二聚体，二聚体为白色结晶粉末，熔点15℃，沸点148℃，能自燃，易溶于水，溶于乙醇、丙二醇，微溶于乙醚，在植物油中几乎不溶自然地存在于玉米、葡萄酒、蜂蜜、可可、黄油、咖啡、草莓和醋栗等物质中，由于其具有特有的奶油香味，因此多用于奶油、干酪、咖啡、坚果的香味巩固剂，同时也可用于配制奶油、乳品、酸乳和草莓型香精等，啤酒风味、奶酪香味均与乙偶姻有关由于其具有特有的奶油香味，乙偶姻在食品、香料以及打扮品等行业都有着分外重要的用途 1.1.2 乙偶姻的应用 （1） 在食品中的应用：乙偶姻是国际上常用的香料品种主要用作奶油、乳品、酸乳和草莓型等香料的生产，80%含量的乙偶姻俗称“醋嗡”，是酒类调香中一个极其重要的品种； （2） 在制药行业的应用：可用来生产医药中间体，较大程度地提高药效，减轻药物的副作用； （3） 在烟草行业的应用：乙偶姻、1-戊烯-3-醇、1-戊醇等成分具有典型的香气特征，对烟叶香气具有良好的影响，是特香型烤烟品种中特殊香气风格的主要物质根基； （4） 在化工行业的应用：乙偶姻可以用做含氯聚合物的稳定剂，石油行业的起泡剂，而乙偶姻与脂肪二元羧酸形成的酯可以用做防冻剂和增塑剂。

乙偶姻还可以作为一种新兴的平台化合物，广泛应用于其他行业，2022年美国能源部将其列为30种优先开发利用的平台化合物之一[1] 1.2 乙偶姻的生产 1.2.1 丁二酮片面加氢恢复生产乙偶姻 目前国内外研究及应用较多的乙偶姻生产方法是2,3-丁二酮片面加氢恢复的方法[2],回响原理如图： 该方法主要是以 2,3-丁二酮为原料通过添加不同的催化剂、恢复剂来加氢恢复得到乙偶姻张小舟[3]等人对以 2,3-丁二酮为原料的乙偶姻化学合成工艺举行了研究，以锌为恢复剂，探索了该恢复回响的规律而 Martin Studer 等 那么应用改性的铂作为催化剂对2,3-丁二酮举行选择性的加氢恢复，得到具有确定旋光度的乙偶姻 1.2.2 2,3-丁二醇选择性氧化法生产乙偶姻 人们对于2,3-丁二醇选择性氧化法生产乙偶姻的探索主要集中在空气氧化法和电化学氧化法空气氧化法即在装填铜刨花的回响器中，将2,3-丁二醇与空气加热至315oC后通过管式回响器，通过被空气氧化得到乙偶姻电化学氧化法即通过电解，使2,3-丁二醇失去H质子后变成负离子，向正极迁移从而发生氧化回响。

电化学氧化法只需使回响温度维持在40oC，电池电压为0.8V即可实现回响 上述两种化学法都存在产品收率低，较难实现产业化，环境污染严重等缺点，最严重的是上述两种方法的原料来源（2,3-丁二醇和丁二酮）均来自石油，随着石油资源的日益枯竭，这两种原料的本金将越来越高，必将增加乙偶姻的生产本金，更加不能得志人们对乙偶姻的消费需求，因此迫切需要一条可持续的乙偶姻生产工艺 1.2.3 生物法生产乙偶姻 基于上述两种化学法合成乙偶姻工艺路线的缺点以及人们对产品质量的担忧，人们开头将目光集中在用生物合成法来替代化学合成法，以期减轻环境资源压力，提高产品质量 1.2.3.1 酶转化法生产乙偶姻 Hummel[4]等通过分开纯化乳酸菌或酵母菌中的丁二酮恢复酶，以NADPH为辅酶，在pH5.0，70oC下用该恢复酶催化丁二酮的恢复，得到乙偶姻该方法产率最高可达成100%，且没有其他副产物De Faveri[5]等开发了一种附有醇脱氢酶活力的膜回响器，采用汉氏醋杆菌(Acetobacter hansenii) MIM2000/5全细胞催化2,3-丁二醇合成乙偶姻，考虑各种因素，在最适条件下2,3-丁二醇转化为乙偶姻的最大摩尔转化率达71.6%。

酶转化法与化学合成法相比，酶法产物得率高，没有其他副产物，但要获得大量特异性的酶对比困难，并且原料与化学法一致，都为丁二酮或2,3-丁二醇，存在同样的原料限制，因此酶法并没有从根本上变更乙偶姻的生产现状 1.2.3.2 发酵法生产乙偶姻 自然界中某些细菌具有产乙偶姻的才能，能以糖质为原料举行发酵生产，但通常乙偶姻是作为丁二酮和2,3-丁二醇的副产物，产量较少因此从自然界中筛选分开到能够高产乙偶姻的菌株是提高发酵法生产乙偶姻转化率的一个重要环节赵祥颖等[6, 7]选育获得了一株高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌SFA-H31 (CGMCC 1869)，可有效地转化葡萄糖生成乙偶姻，转化率高达48.26%，接近理论转化率（48.9%）[8]，且该菌不产丁二酮和2,3-丁二醇，是一株极具研究价值的乙偶姻生产菌株此外Xu[9]等也分开纯化出一株短小芽孢杆菌XH195（DSM 16187），该菌株发酵生产乙偶姻的发酵单位达80 g/L，是目前报道的乙偶姻发酵单位最高的菌株，它能在含氯化钠质量浓度为100 g/L的培养基上生长，并能以葡萄糖或蔗糖为碳源，37oC下发酵60 h后，乙偶姻的产量分别达63.0 g/L或58.1g/L。

此外由于以葡萄糖或其他能够转化生成丙酮酸的化合物为底物发酵生产乙偶姻的代谢途径已经研究得对比领会[10, 11]，因此可以通过这一点，通过基因工程手段得到能够高产乙偶姻的菌株在微生物体内，有两条主要的乙偶姻合成途径： 两分子丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶的作用下合成一分子α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在酸性条件下非酶自然氧化脱羧生成丁二酮，丁二酮又可在丁二酮恢复酶或2,3-丁二醇脱氢酶的作用下恢复为乙偶姻，该氧化途径已得到大量生化、分子生 [11, 12] 物学的数据支持；另一条途径是在α-乙酰乳酸合成后，经α-乙酰乳酸脱羧酶生成乙偶姻通过这两条途径生成的乙偶姻还可进一步被2,3-丁二醇脱氢酶恢复成2,3-丁二醇因此可以通过基因工程手段敲除编码这两个酶的基因以使这两个酶失活，阻拦乙偶姻向2,3-丁二醇和丁二酮的转化，从而达成积累乙偶姻的目的 1.3 乙偶姻新陈代谢的生理意义 1.3.1 维持 pH 稳定，贮存碳源 细菌由于将丙酮酸代谢为乙偶姻或 2,3-丁二醇而制止了酸性产物在胞内的积累[13,14]，维持了 pH 稳定，制止了菌体的过早衰亡；同时由于在葡萄糖等能源利用完之后，乙偶姻能被作为替代的能源或碳源[15]，因此在细菌体内乙偶姻和 2,3-丁二醇的合成也是一种能源贮备策略[16, 17]。

1.3.2 维持 NAD/NADH 比值的稳定 乙偶姻和 2,3-丁二醇之间的可逆转化是和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）与恢复型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide hydrogenated，NADH）之间的转化相偶联的，因此乙偶姻/2,3-丁二醇代谢途径也被认为参与了细菌中维持 NAD/NADH 比率的稳定和平衡[17, 18] 1.4 研究的背景与意义 乙偶姻在食品、制药、化工等行业都有重要用途，乙偶姻的生产已经研究的对比透彻，其中包括化学法和生物法，由于化学法有产率不高、原料来源缺乏等缺陷，日益显现出世物法生产乙偶姻的优势一般可由可再生的生物质原料通过细菌发酵来生产乙偶姻 其次章 测验 2.1 前 言 基因工程技术是蛋白质工程的根基，它使从基因水平上改造微生物蛋白质成为了可能，而基因工程技术的第一步就是目的基因的克隆，基因克隆是指将目的基因从生物体基因组中分开并与载体 DNA 连接构成的 DNA 重组体在受体细胞内举行复制、扩增的技术。

基因工程技术为基因的布局和功能的研究供给了有力的手段 在异源蛋白的表达中，大肠杆菌由于其背景明显得到了广泛的应用当前己商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是本金低、产量高、培养周期短，易于操作pET 系列载体是 Novagen 公司开发的一种分外有效的原核表达载体，利用 Lac 操纵子序列以及 Lac I 基因构建的以 T7 启动子为根基的表达载体，使外源基因的表达直采纳 IPTG 的诱导Lac I 产生的阻遏蛋白与 Lac 操纵基因结合，从而不能举行外源基因的转录及表达，此时宿主菌 举行正常生长，积累生物量，当向培养基中参与 Lac操纵子的诱导物 IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，那么外源基因大量转录并高效表达 2.2试验方法 2.2.1培养基及菌种保藏条件 LB 培养基：蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母粉 5 g/L，调理 pH 为 7.2，121°C 高压蒸汽灭菌 20 min 菌种保藏：菌种短期保藏采用斜面于冰箱4oC 保藏，长期保藏是用过夜培养的菌液与 40%的灭菌甘油等体积混合，混匀后置于-80oC，可保藏一年以上。

若需保藏时间更长一些的那么需要举行冻干保藏，概括做法如下：将适当浓度（一般为 10%）的脱脂牛奶1-2 ml 参与长满菌苔的固体斜面，充分混匀后，吸取 0.5 ml 参与事先灭菌的冻干管中，用灭菌脱脂棉封口，冷冻枯燥，然后抽真空，并同时对管体举行加热熔融，封口冻干保藏的菌株由于保藏环境真空度高，湿度小等优点，能存活 5-10 年 2.2.2基因组 DNA 的提取 使用 TIANGEN 的细菌基因组 DNA 提取试剂盒对菌体举行 DNA 提取概括操作如下： （1） 取细菌培养液 1-5 ml，10,000 rpm 离心 1 min，尽量吸净上清； （2） 向菌体沉淀中参与 200 μl 缓冲液 GA，振荡至菌体彻底悬浮； （3） 向管中参与 20 μl 蛋白酶 K 溶液，混匀； （4） 参与 220 μl 缓冲液 GB，振荡 15 s，70oC 放置 10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内的水珠； （5） 加 220 μl 无水乙醇，充分振荡混匀 15 s，此时可能会展现絮凝状沉淀，简短离心以去除管内壁的水珠； （6） 将上一步所得溶液和絮状沉淀都参与一个吸附柱 CB3 中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm 离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中； （7） 向吸附柱 CB3 中参与 500 μl 缓冲液 GD，12,000 rpm 离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中； （8） 向吸附柱 CB3 中参与 700 μl 漂洗液 PW，12,000 rpm 离心 30 s，倒掉废液，吸附柱 CB3 放入收集管中； （9） 向吸附柱 CB3 中参与 500 μl 漂洗液 PW，12,000 rpm 离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中； （10） 将吸附柱 CB3 放入收集管中，12,000 rpm 离心 2 min，倒掉废液；将吸附柱 CB3开盖置于温室放置数分钟，以彻底晒干吸附材料中剩余的漂洗液； （11） 将吸附柱 CB3 转入一个明净的离心管中，想吸附膜的中间部位悬空滴加 50-200μl 洗脱缓冲液 TE，温室放置 2 - 5 min，12,000 rpm 离心 2 min，将溶液收集到离心管中，收集管中得到的就是菌体的 DNA； （12） 得到的 DNA 于-20oC 存放，备用。