常用分子克隆实验方法.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑常用分子克隆实验方法 常用分子克隆测验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1：提取吸附法无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理 (1) 充分研磨称取约0.2克植物组织，参与液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，持续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将全体溶液移至1.5ml离心管中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附往上清液中参与1倍的异丙醇，轻轻混匀，再参与总体积1/4已混匀的 溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口， 再用移液枪吸走大片面剩余液体； (5) 75%乙醇清洗参与1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍 吸离心管口重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残液，晾干5min； (6) 核酸洗脱参与约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。

方法2：CTAB法，此为在经典方法根基上，经过摸索提升，提高了得率，裁减了污染 (1) 充分研磨称取约0.2克植物组织，参与液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，持续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃水浴30-60min (2) 氯仿抽提10,000rpm离心3min，取约600ul上清参与1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍 (3) 核酸沉淀参与预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃 上清 (4) 清洗沉淀轻参与1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min (5) 溶解DNA加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏 1 二、植物总RNA的小量提取 操作前务必对枪头，桌面等举行酒精擦洗，最好戴口罩，并实时更换手套，试剂应专用，吸头与离心管应Rnase free. 方法1：离心柱法，其特点是无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质， DNA污染少。

(1) 充分研磨取植物组织材料约0.1克，参与液氮尽可能充分研磨3-5min，稍后参与 约500ul溶液B，持续研磨至略微粘稠的组织匀浆； (2) 高速离心去杂质用1ml吸头将全体溶液移至1.5ml离心管中，常温下，10,000rpm 离心5min，取上清（约400ul）至已充分甩干的吸附柱中； (3) 核酸吸附往柱中补加1/4体积异丙醇，静置3min，然后5000rpm离心30s，弃滤 液，滤液较多时，宜分两次，每次15s； (4) 75%乙醇清洗往柱中加400ul75%乙醇，10,000rpm离心15s，弃滤液重复此步 骤一次，再将空柱子在10,000rpm离心15s，然后将柱子直接转移至新Rnase free 1.5ml管； (5) 核酸洗脱往柱中硅土参与45ul DEPC水，静置3min，10,000rpm离心1min，所 得滤液即为RNA样品可取5ul通过普遍琼脂糖电泳检测提取效果，样品应立刻参与0.5ul/10ul的RNA酶抑制剂，并保存于-20℃（3个月）或-70（6个月）℃ 方法2：Trizol法，结合氯仿抽提，异丙醇沉淀。

(1) 充分研磨取植物组织材料约0.1克，参与液氮尽可能充分研磨3-5min，稍后参与 约500ulTrizol溶液，持续研磨至略微粘稠的组织匀浆；或者将粉末转入1.5ml离心管，再加500ulTrizol溶液，强烈混合1min (2) 氯仿抽提用1ml吸头将全体溶液移至1.5ml离心管中，参与1倍的氯仿，振荡混 匀，10,000rpm离心3min，取上清重复抽提1遍 (3) 核酸沉淀参与预冷的1倍异丙醇，混匀，10,000rpm离心5min，弃上清 (4) 清洗沉淀轻参与1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，横放于离心管架上，在 超净台中吹5min (5) 溶解RNA参与DEPC处理过的水40-50ul，静置几分钟直至沉淀溶解，可通过普 通琼脂糖电泳检测提取效果，再补充参与0.5ul/10ul的RNA酶抑制剂，并保存于-20℃（3个月）或-70（6个月） 2 三、质粒小提 方法1：碱裂解法 (1) 收获菌体摇过夜（12h以上）的菌液按1.5ml分装，冰浴，10,000rpm离心30s， 倒掉上清，倒置或晾放于离心管架上，同时用小枪头吸走管底和盖上的残液。

(2) 溶菌与变性参与预冷的溶液I 100ul，混合器充分悬浮菌液，冰浴逐管参与溶 液IIA（2%SDS溶液，无需预冷）100ul，全部加完后每管补加预冷的溶液IIB（0.4M NaOH溶液）100ul，快速颠倒混合5次，随加随混，并立刻放回冰浴，静置3min (3) 去蛋白和基因组加预冷的溶液III（Kac溶液）150ul，用碗力轻摇10s，随加随摇， 并立刻放回冰浴，静置3min以上，10,000rpm离心5min（也可分两次换离心管，每次2min），吸出上清约400ul至新1.5ml离心管，冰浴 (4) 沉淀和清洗参与2倍体积预冷的乙醇，轻轻混匀，可立刻10,000rpm离心3min， 弃上清，同时用小枪头吸走管底残液每管轻参与1ml 75%乙醇，再吸走乙醇，并倒置或晾放5min (5) 溶解核酸加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min后，取约 2-3ul电泳检测，-20℃冷冻保存 四、核酸回收与纯化 方法1：溶液B柱式回收法，其特点是效率高本金低，适用于电泳和核酸溶液直接回收 (1) 溶液混合溶液B比例为：胶回收为3倍的胶重（毫克数）或以每小孔150ul计算； 核酸溶液为3倍的体积，溶液B底限为300ul。

溶胶可采用55℃水浴3-5min或直接用混合器混合1min即可溶胶 (2) 核酸吸附上柱前，往混合溶液中参与1/3 B溶液体积的异丙醇有助于提高回收率 将混合溶液移至柱中，静置3min以上，5000rpm离心30s，若溶液较多，可分两次，每次15s (3) 75%乙醇清洗400ul75%乙醇，10,000rpm离心15s，弃滤液重复此步骤一次， 再将空柱子在10,000rpm离心15s，然后将柱子直接转移至新1.5ml管； (4) 核酸洗脱往柱中滴加1/10 左右B溶液体积的双蒸水或TE(PH8.0)溶液（55℃预 热效果更好），静置3min以上，10,000rpm离心1min，所得滤液即为回收核酸样品 3 五、RT-PCR根本方法 按照Promega试剂盒方法举行总结，融合了3’RACE技术 逆转录阶段：（下述为20ul体系，推举使用40ul体系） 操作前务必对枪头，桌面等举行酒精擦洗，最好戴口罩，并实时更换手套，试剂应专用，吸头与离心管应Rnase free (1) 变性与退火打定Rnase free 1.5ml离心管，参与： 总RNA（总样品约40ul） 9.5ul（一般5-10ul）； 3’Race引物（60uM，1管约50ul） 1.5ul； 短暂离心，70℃水浴5min，常温短暂离心，冰浴。

(2) 逆转录按依次参与（成分及含量各试剂盒有所不同）： MgCl2(25mM) 4ul； 10X buffer 2ul； dNTP(10mM) 2ul； Rnase Inhibitor 0.5ul； 常温，轻轻混合，短暂离心，参与AMV(25u/ul) 0.6ul，45℃ (MMLV只能为42℃)水浴60min (3) 终止回响在刚煮沸过的水浴（99℃）中放置5min（MMLV为70℃ 10min），冰 浴5min，-20℃冷冻一般每25ul PCR体系加2-3ul作模板 PCR阶段： (1) PCR体系（约25ul体系）： H (H2O) 16ul； P (Primer) 基因特异引物1ul + 3’ 嵌套引物 1ul； B (Buffer) 2.5ul； M (Mg2+) 1.5ul； N (dNTP) 0.5ul； E (Taq) 0.125ul； T(Template) 2-3ul 逆转录产物； PCR程序为： 300s 94℃； 30-35个循环：94℃ 30s；60℃ 60s；72℃ 60-90s； 300s 72℃ (2) 回收后再PCR。

确定目标条带展现的位置，举行回收后PCR（一般扩增两个模板 梯度），同时三个对照（空白，两个单条引物），全部电泳回收，T载体连接 4 六、T载体构建 方法1：单酶切加T法 (1) 质粒单酶切取2管各约50ul 小提的PBS质粒，分别以如下100ul体系37℃酶切 6h以上（可以过夜）： PBS或其它质粒 50ul； EcoRV Buffer（R+） 10ul； EcoRV 2ul； ddH2O 38ul (2) 酶切产物回收以3倍体积溶液B回收200ul核酸溶液（见溶液B柱式回收法）， 70ul ddH2O溶解产物取5ul稀释至50ul，测定核酸浓度，一般要求浓度100ng/ul以上，而总量务必大于5ug (3) 加T回响回收产物加水总量为77ul，100ul体系的其余组成为： PCR buffer 10ul； Mg2+ 6ul； Taq(5u/ul) 5ul； dTTP（100mM） 2ul。

70℃水浴2h (4) 产物回收及检测以3倍体积溶液B回收100ul核酸溶液，40ul TE（PH8.0）溶解 产。