MEF及饲养层的制备(实验记录).docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑MEF及饲养层的制备(实验记录) MEF及饲养层的制备（测验记录） 1.MEF的获取：（步骤4－12已经举行实践） （1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵 （2）2：1合笼过夜(雌：雄)* r% m) E3 Y6 i\ （3）取出有阴道栓（即乳白色或淡黄色冻胶状物，确定其已经怀孕）的开头记时间为0.5天 - U1 }- b) o* p （4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为测验材料 （5）颈椎脱臼法处死孕小鼠，放于盛有75%酒精的烧杯中消毒，拿到超净工作台上解剖，先剖开腹部皮肤，暴露子宫，然后换另外一套手术器械，用眼科镊提起近子宫颈端,分开子宫系膜,剪断子宫角，取出子宫，置于装有PBS的培养皿中 （6）取出胎鼠，在PBS中洗涤数次去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部在PBS中充分漂洗，弃除红细胞用两个镊子合作即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)（若是想培养神经干细胞，那么用剪刀剪取前脑举行培养即可）（可以一起处理多个胚胎）1 n. s# @$ g$ @ （7）在新的培养皿中参与少量PBS，放入躯干片面，用眼科剪刀剪成1mm3以下的组织块碎片（可以剪的更碎一点，下步的消化时间就可以缩短）。

（8）参与2~4ml 0.25%胰蛋白酶，培养箱中消化10—15min，消化终止后参与等体积（多加点也行，只要不是少加，保证彻底的终止消化回响）的MEF Medium终止消化回响，轻轻吹打，使细胞分散做原代消化的时间稍长，胰酶用量也大，若是做传代，那么只需参与500微升，最多1ml的胰酶，消化1~3min躯干组织不易消化，做原代和传代时，故都用0.25%胰蛋白酶；而脑组织较易消化（脑肿瘤组织），原代和传代都用0.05%胰蛋白酶消化可能不完全，也可室温静置5－10min，弃组织块，这样下面过滤就相对轻易假设消化得到的细胞太少，可以离心弃上清，PBS洗涤，重新加胰酶消化）（胰蛋白酶，Trypsin ,最适条件pH8.0，37度，溶液中钙镁离子和血清会降低其活力，故消化用的胰蛋白酶中参与了EDTA消化终止时参与含血清的培养基即可终止回响） （ 9）将收集的细胞悬液离心，1500rpm， 4min，弃上清，参与红细胞裂解液（3~5倍体积的细胞体积），轻轻吹打1min，离心除上清，若仍有红细胞残留，那么须持续举行红细胞裂解步骤 （10）离心，弃上清，重悬细胞，过滤（200目筛网）并收集滤液，离心除去上清。

（11）用MEF Medium洗涤沉淀，离心除上清，重悬细胞，铺板即可置于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养一只老鼠会有多个胚胎，得到的单细胞，可铺到三个培养皿中或者更多的培养皿中举行培养） （12）其次天换液，随后每2天换液一次培养2～4d后，MEF接近会集，即可按1:3比例传代培养 ' u3 Z9 u6 w6 E w- q 要点: 无菌是操作关键, 动物皮毛不能直接或间接接触到子宫, 分开子宫时务必换用另一套无菌的眼科剪和眼科镊培养同一株胚胎干细胞最好延用一致品系小鼠来源的成纤维细胞 要点: 留心查看原代细胞有无被杂菌污染的迹象, 并且检测支原体, 确定无污染后传代扩增2 V) G5 o. f% D* Y7 v, _ 2.MEF传代（本步骤已经举行实践） （1）消化：吸去培养皿中的MEF Medium，用PBS洗涤1次(加5ml)后，参与1ml 0.25%Trypsin/EDTA 37度消化1min（时间可以浮动，视消化效果定，在显微镜下查看, 当少量细胞漂泊, 贴壁的细胞层展现裂隙时，即可终止回响） （注：加PBS洗涤，是为了除去血清，否那么胰酶发挥不了作用）2 m6 \\, x. X' ^) v （2）终止消化：参与5ml MEF Media终止消化（此时总体积为6ml），用吸管冲洗培养面并反复吹吸，使细胞离散成为单细胞悬液。

离心步骤省略：将细胞悬液移入离心管，1500rpm×4min弃去上清液，用MEF Media重悬MEF成单细胞悬液)5 q; x' A- M7 I7 _7 @ L/ F3 y 留神: 每次传代尽量把成纤维细胞消化、吹打成单细胞悬液. 3.冻存MEF（本步骤已经举行实践）# ^3 f% ]) N7 h) M6 r5 K 5 L: u+ ]; j @( h 在P2传P3代时，取三分之一的dishes持续举行MEF传代操作，另外三分之二举行冻存处理（本测验中P2有27个dishes，其中8个持续做传代，成24个dishes；另外19个做冻存处理，每个dish冻存一管） （1）取出19 dishes，吸弃media，加PBS洗一次（5ml）3 k E) w) r2 Y+ ^ k 三冻存液使用的是MEF media + 10%DMSO，这样FBS含量少，对细胞状态产生影响，下次要增加FBS的含量（适当增加FBS的量有利于提高复苏时细胞的成活率）MEF media由DMEM 11965 +10?S+1%P/S） ' p4 S5 y) p; x+ M0 X( m\ ( z0 ]- h ] 1 Y\ 4. mitomycin C处理MEF，并冻存（本步骤已经通过实践）1 Z\ （1）当P3代MEF生长接近会集时，吸去原培养基，用PBS洗2次（每次5ml），然后参与4ml 10μg/ml的mitomycin C处理MEF细胞，置于培养箱内2h。

（2）弃去mitomycin C，用PBS洗涤2次（每次5ml） H$ I/ T I! \\' Z. r ' w) X1 C8 R0 B6 b& K: A 5.复苏（本步骤已经通过实践） （1）取出冻存管，在37度水浴中急速溶解（1－2min），当有少量冰块剩余时取出，用吸水纸拭干水，用75%酒精喷一下剩少量冰块与完全溶解，效果区别不大也可完全溶解） （2）用移液枪把冻存液转移至已加有5mlMEF Media的15ml离心管中1000转，4度，4min，离心 （3）2ml MEF Media 重悬，转移至加有8ml MEF Media的100mm培养皿中，于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养 — 5 —。