核酸的生物化学幻灯片.ppt

核酸的生物化学,李金明 卫生部临床检验中心,核酸(Nucleic acid)?,,愚蠢的分子?,核苷酸的简单排列,蛋白质的丰富多彩,A是B的DNA,这里B不是生物体 A不是DNA 这句话想说的是:A是B的本质、精华,核酸研究的历史,核酸研究的历史,不久，科塞尔（Albrecht Kossel）发现“核素”是蛋白和核酸的复合物，并明确了核酸各组成成分的比例(核酸化学领域的第一缕曙光),,,,,,,Friedrich Miescher,Albrecht Kossel (获1910年诺贝尔生理学医学奖),1869 米舍尔（Friedrich Miescher 从脓球分离出细胞核，不受蛋白酶分解，磷含量高，命名为“核素” (nuclein),核酸研究的历史,1911 科塞尔的学生莱文(P.A.T. Levine）证明核酸中所含的糖由5个碳原子所组成，命名为核糖阐明了胸腺组织和酵母中分离到的核酸的不同,前者为脱氧核糖核酸(DNA), 后者为核糖核酸（RNA）核酸研究的历史,1934 莱文发现核酸可被分解成含有一个嘌 呤或嘧啶、一个核糖或脱氧核糖和一个磷酸的片段，这样的组合叫“核苷酸” 他们根据当时比较粗糙的分析认为，4种碱基 在核酸中的量相等，从而错误地推导出核酸的基本结构是由4个含不同碱基的核苷酸连接成四核苷酸，以此为基础聚合成核酸，这就是较著名的“四核苷酸假说”。

核酸研究的历史,1944 美国微生物学家埃弗里（O.T. Avery ）等的肺炎球菌转化实验,O.T. AVERY,核酸研究的历史,Erwin Chargaff,1950 查伽夫（Erwin Chargaff） et al- Chargaff法则,核酸研究的历史,1952 赫尔希和蔡斯（HERSHEY, CHASE）-噬菌体标记实验,Alfred Hershey and Martha Chase,核酸研究的历史,1953 沃森和克里克（WATSON，CRICK）-DNA双螺旋,Francis Crick and James Watson (获1962年诺贝尔生理学医学奖),Maurice Hugh Frederick Wilkins,Rosalind Franklin,为什么是这两个年轻人？,沃森：生物学，研究噬菌体 克里克：物理学、化学 不是因为勤奋（成绩平平），而是因为其独有的想像力沃森和克里克却是“站在巨人的脚趾上” --布拉格在为双螺旋写序时，戏称他们我之所以能够看得更远，是因为我站在巨人的肩膀上 -- 牛顿,“因为他们连跑上巨人的肩膀上功夫都没花”,核酸研究的历史,1955 托德(Alexander Robertus Todd)用磷酸三酯法合成了二核苷酸TpT 这是人工合成DNA大分子的前奏,,,,,Alexander Robertus Todd (获1957年诺贝尔化学奖),核酸研究的历史,1960年代中期 桑格(Sanger)的DNA测序法,Frederick Sanger (获1958和1980年诺贝尔化学奖),,核酸研究的历史,1972 伯格(Paul Berg) 重组DNA技术 引起人肿瘤的猴病毒基因与噬菌体lambda的重组 1973 博耶（Herbert Boyer）和科恩（Stanley Cohen）-使用重组DNA技术首次得到了重组DNA微生物(基因工程技术),Paul Berg (获1980年诺贝尔化学奖),Herbert Boyer and Stanley Cohen,核酸研究的历史,1983 穆利斯（Kary Mullis) PCR技术,,核酸研究的历史,1990 Human Genome Project,后基因组时代--基因组学,功能基因组学 研究的核心问题有：基因组的多样性（SNP、药物基因组学）；基因组的表达及其时空调节（基因芯片、蛋白质组学等）；模式生物基因组研究（基因剔除）等,,后基因组时代--基因组学,结构基因组学 结构基因组学，是由结构生物学与功能基因组学紧密结合所产生的，其科学目标就是要规模化地测定蛋白质、RNA及其它生物大分子的三维结构。

核酸的种类,DEOXYRIBONUCLEIC ACID（DNA） RIBONUCLEIC ACID（RNA） ribosome RNA(rRNA) transfer RNA(tRNA) messenger RNA(mRNA),核酸的分布,DNA RNA 核（%） 98 90,核酸的含量,DNA恒定 RNA与细胞生长状态有关,核酸的功能,DNA-遗传 RNA-参与蛋白质合成,核酸的分子组成,元素组成 C H O N P （恒定，910%） 基本结构单位核苷酸,,n核苷酸（nucleotide), 核酸多聚核苷酸（polynucleotides),磷酸,核苷（nucleoside),戊糖-ribose(R) deoxyribose(dR),碱基 A G U C A G T C,DNA、RNA组成异同,RNADNA 戊糖核糖脱氧核糖 Adenine (A)Adenine (A) 碱基 Cytosine (C)Cytosine (C) Uracil (U)Thymine (T) Guanine (G)Guanine (G) 链的数量常为单链双链 热稳定性?不稳定稳定,,,,,,,,,,,,Adenine,Cytosine,Guanine,,Thymine,核糖和磷酸,,,Deoxyribose,Phosphoric Acid,O,核苷、核苷酸,其它核苷酸:NAD(辅酶I)、FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)、cAMP、cGMP、5-FU、6-MP,2、3、5NMP(一磷酸核苷)， 3、5dNMP， 主要是5NMP、dNMP，DNARNA组成 NTPdNTP NDPdNDP 多磷酸核苷酸，能量代谢 环核苷酸 cAMP、cGMP 第二信使 NADNADP FADFMN 辅酶，生物氧化 抗代谢药物 6MP，5-FU,核酸的分子结构,核酸的一级结构,5 end,3 end,核苷酸的连接3,5磷酸二酯键,表示法 pCpCpA pC-C-A 5-CCA-3,,DNA的分子结构,DNA的碱基组成（CHARGAFF法则） 有种属特异性 无组织、器官特异性 不受年龄、营养和环境的影响 不论种属、组织来源，所有DNA分子 A T、G C A/T G/C 1 A + G T + C,DNA 的分子结构,Hydrogen Bonds,,,,,,Cytosine,Adenine,Thymine,Guanine,,,Deoxyribose (Sugar molecule),Phosphoric Acid (Phosphate molecule),DNA的二级结构双螺旋结构,Watson, Crick （1953）在Chargaff法则及Wilkins,Franklin的X线衍射工作基础上提出DNA的double helix结构模型 DNA分子由相互平行、走向相反、碱基互补的两条脱氧核糖核苷酸链围绕同一中心轴，盘绕成双螺旋结构，螺旋的一侧为大沟，另一侧为小沟。

磷酸脱氧核糖形成的长链骨架在外，碱基在内，两平行链对应碱基间以氢键相连；对应碱基总是A==T、G === C配对（base pairing)或互补，形成稳定联系 各碱基平面垂直或基本垂直于双螺旋中心轴，链内碱基间形成纵向Vander Waals力与长轴平行，使双螺旋更稳定 相临碱基对间距离为0.34nm,每周螺距为3.4nm (10bp), d为 2nm (B型）,DNA double helix类型,helix type bp/turn rotation/bp vertical rise/bp helical d A 11 +34.7 2.56A 23A B 10 +34.0 3.38A 19A C 9.33 +38.6 3.32A 19A Z 12 -30.0 5.71A 18A,DNA的高级结构,超螺旋 如线粒体DNA 细菌质粒DNA 病毒DNA,DNA的高级结构,核小体结构：由DNA和组蛋白共同构成 2 (H2AH2B H3 H4 )/DNA(146bp) =核心颗粒 超螺线管染色质：由核心颗粒与连接区构成的核小体彼此串联，成串珠状，再进一步卷曲，形成超螺线管结构。

RNA的分子结构,RNA的种类：tRNA、rRNA、mRNA RNA的碱基组成： A U G C 稀有碱基（假尿嘧啶、甲基化碱基） RNA的一级结构：核苷酸序列 3,5磷酸二酯键连接 RNA高级结构,tRNA的结构,一级结构 7090 nt 二级结构 三叶草形状： 特点（1）氨基酸臂：3CCA-OH结构可与活化的氨基酸结合2）DHU环（二氢尿嘧啶）3）反密码环：可与mRNA中三联体构成反密码子，在蛋白合成中起解读密码子，将对应氨基酸引入合成位点的作用4） T环：含胸腺嘧啶核苷和假尿嘧啶核苷为特征5）额外环：是tRNA分类的标志 三级结构 倒“L”形,,,,,,ACC,DHU环,T环,反密码环,5,额外环,mRNA的结构,3-poly A(30200)，为mRNA的“尾” 5-7甲基鸟苷三磷酸，为mRNA的“帽” 分子中有编码区和非编码区中间为密码子 Codon这些三联体密码子决定蛋白质的一级结构,,核酸的理化性质：含量和分子大小,细胞中核酸含量依种属及组织而定，如酵母含0.1%，肌肉组织及细菌含0.5% 1%，在胸腺及精细胞中，含量高达1540% 分子大小可用长度、硷基对数目及分子量表示。

长1m的DNA含3000硷基对，相当于分子量为2106 daltons DNA分子大小测定的经典方法：超速离心测沉降系数（S）,核酸的理化性质：酸性化合物,两性但酸性强：DNA、RNA在其多核苷酸链内既有酸性的磷酸基又有碱性的含氮杂环碱，因此核酸与蛋白质一样，也是两性电解质因磷酸基的酸性较强故通常核酸表现为酸性 电泳行为泳向正极（pH7-8）：在中性或碱性溶液中，核酸带负电荷，在外加电场作用下向阳极移动 沉淀行为加盐（中和电荷） M+与磷酸“-”中和；乙醇：带负电荷的核酸可与金属离子成盐当向核酸溶液中加入适当盐溶液后，带正电荷的金属离子即可将核酸的负离子中和，在有乙醇或异丙醇存在时核酸即可从溶液中沉淀析出制备核酸时常用的盐溶液有氯化钠、醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵核酸的理化性质：降解,酸水解：DNA较RNA更敏感，N糖苷键断裂，嘌呤硷比嘧啶硷更不稳定 硷水解：DNA对硷稳定，硷水解多用于RNA硷使RNA分子中磷酸二酯键的磷酸与C-5酯键水解断裂，生成2核苷酸与3核苷酸的混合物 酶降解：内切酶（胰DNase I)、外切酶（蛇毒磷酸二酯酶）,核酸的理化性质：高分子性质,粘度 DNARNA 核酸的分子量很大，核酸溶液具有较大的粘性。

DNA分子的长度与其直径之比可达107，因此即使极稀的DNA溶液也有较大的粘度RNA溶液的粘度较DNA为小当核酸溶液受热或酸碱等因素作用下发生变性时，分子长度与直径比例减小，分子不对称性变小，溶液粘度下降 粘度测定可用作DNA变性的指标核酸的理化性质：高分子性质,超离心沉降 不同种类核酸分子的大小不同核酸分子大小表示方法有以下几种：即千道尔顿(kD)、碱基对(bp)或千碱基对(kb)数目、离心沉降常数(s)离心沉降常数是利用高分子的核酸分子大小不同，分子形状不同，在超离心力场作用下的沉降行为也各不相同而测得如真核生物核糖体小亚基中含的rRNA分子大小为18S，大亚基中的rRNA有28S、5S和5.8S三种分子核酸的理化性质：高分子性质,凝胶过滤 高分子的核酸还表现为特异的凝胶过滤(如葡聚糖凝胶)洗脱行为，洗脱时分。