植物生理生化实验.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑植物生理生化实验 测验一 植物组织游离氨基酸含量测定—茚三酮试剂显色法 P199 原理：游离氨基酸与茚三酮共热时能定量生成二酮茚-二酮茚胺，产物呈蓝紫色，称Rubemans紫其吸收峰在570nm，且在确定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量 ①微酸、90℃：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被恢复成恢复型茚三酮 ②脱水：恢复型茚三酮与另一分子茚三酮和一分子氨举行缩合脱水，生成二酮茚-二酮茚胺 材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻 测验步骤： 分别取1g萌发、未萌发水稻于研钵中，参与5ml醋酸（使蛋白质变性，沉淀），研磨成匀浆后，用无氨蒸馏水稀释至100ml用枯燥滤纸过滤到三角瓶中如下操作 试管编号 试剂 样品提取液ml 无氨蒸馏水ml 0.1抗坏血酸ml 水合茚三酮ml 570nmOD值 每管含氮量 0 0 空白1 0 2.0 0.1 3 0.130 1.26 样品1（未萌发） 2 2 0 0.1 3 0.123 1.19 3 2 0 0.1 3 0.188 1．83 样品2（萌发） 4 2 0 0.1 3 0.168 1.83 5 2 0 0.1 3 置于沸水中加热15min，取出用冷水急速冷却并不时摇动，使之呈蓝紫色，用60%乙醇定容20ml，在570nm波长下测定吸光度。

样品氨基态含氮量（ug/100g鲜重）=CVT/VSW *100 ；C=A/k (k=0.103) ； VT=100/2 ； VS=1 ； W=1 留神事项： 1. 测定前所用的玻璃仪器要枯燥，所用的蒸馏水务必为无氨水； 2. 样品要磨匀，用无氨蒸馏水定容，并用枯燥滤纸过滤； 3. 抗坏血酸易被恢复；参与的量要严格操纵，由于恢复剂抗坏血酸会与茚三酮回响； 4. 水浴锅的液面要高于试管内的液面，使其加热平匀，并在加热后几秒再塞上塞子，水浴锅温度要高于 90℃，15min后取出急速冷却，再参与60%乙醇； 5. 稀释后要急速比色； 6. 谷物等蛋白质样品可用酸水解法讲蛋白质水解后，用本法测定氨基酸含量，可计算出样品蛋白质含量； 7. 回响要在无水、有机、微酸的环境下举行最适PH为4.5，是乙醇-乙酸钠缓冲液和醋酸缓和后的PH 斟酌题： 1. 茚三酮与全体氨基酸的回响产物都一致吗？为什么？ 不一致，由于有些氨基酸的布局不同，不含游离的氨基，如脯氨酸 2. 测定植物组织中游离氨基酸总量有何意义？ 可以测定植物对氮的根吸收，测定植物的病理和逆境状态和植物的养分、施肥指标等。

3. 植物组织氨基酸的测定为什么要除去蛋白质？用10%乙酸出去蛋白质的原理是什么？ 由于植物组织中除了游离氨基酸外还有蛋白质，蛋白质会影响测验结果 10%乙酸会使蛋白质变性产生沉淀而被过滤除去 4. 抗坏血酸在测定中的作用是什么？ 作用是养护恢复型茚三酮，防治其被氧化 722S型分光光度计使用：①空白，开启，透射比0%，关上，100%②吸光度模式 1 测验二 植物组织可溶性蛋白质含量测定—Folin酚试剂法 P188 原理：Folin酚试剂法，结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的回响 ①碱性：蛋白质肽键与铜生成紫红色蛋白质-铜络合物 ②络合物和蛋白质中氨基酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸的残基使Folin试剂（磷钼酸-磷钨酸试剂）恢复，产生磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物质 在确定条件下，颜色深浅与蛋白质含量成正相关，其吸收峰在650nm，因此可用分光光度法测定其含量 材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻 测验步骤： 分别取0.5g萌发、未萌发水稻于研钵中+2ml蒸馏水+石英砂，充分研磨，+3ml蒸馏水，定容25ml，放置15min，过滤取上清液备用。

如下操作 编号 牛血清蛋白250ug/ml 蒸馏水ml 试剂甲ml 试剂乙ml 1 0 1．0 2 0.2 0.8 3 0.4 0.6 4 0.6 0.4 5 0.8 0.2 5 摇匀→室温下放置10min 0.5 急速摇匀→室温放置30min 650nmOD值 蛋白质含量 0.000 0 0.112 50 0.154 100 0.255 150 0.474 200 0.551 250 0.167 71.8 0.237 104.8 6 1.0 0 未萌发 酶0.5 0.5 萌发 酶0.5 0.5 样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=XVTN/WVS *1000 ；VT=25；W=0.5；VS =0.5 留神事项： 1. Folin酚试剂只有在酸性条件下才稳定； 2. 试剂甲、试剂乙参与后需要急速摇匀； 3. 回响最适温度在25-30℃； 4. 样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基类化合物均会产生干扰 斟酌题： 1. 请介绍几种常用的可溶性蛋白质测定方法，并对比其优缺点 ①Folin-酚试剂法 优点：灵敏度大、操作简朴 缺点：试剂难配置，易受柠檬酸等化合物干扰 ②考马斯亮蓝G-250法 优点：灵敏度大、操作简朴 缺点：易造成二次污染 ③紫外分光光度法 优点：俭约样品、操作简朴 缺点：切实度差 2. 测定植物体可溶性蛋白含量有什么意义和用途？试举例说明。

可以测定植物的代谢水平、食品中的养分指标 3. Folin-酚试剂法测定可溶性蛋白的原理是什么？测定中应留神什么问题？ 原理 测定时要留神最适温度为25-30℃，Folin-酚试剂只有在酸性条件下才稳定，并会受到柠檬酸等化合物的干扰 2 测验三 植物组织Vc含量测定—滴定法 P268 原理：Vc具有很强的恢复性，染料2,6-二氯酚靛酚具有较强的氧化性，且在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色当用蓝色碱性2,6-二氯酚靛酚溶液滴定含有抗坏血酸的草酸溶液时，其中的抗坏血酸可以将2,6-二氯酚靛酚恢复成无色的恢复型但当溶液中的抗坏血酸完全被氧化之后，那么再滴加2,6-二氯酚靛酚就会使溶液呈红色，借此可指示滴定终点根据滴定消耗的2,6-二氯酚靛酚溶液的量，可计算出被测样品中抗坏血酸的含量 材料：白萝卜 操作步骤：5g白萝卜于研钵中，参与少量2%草酸和石英砂，快速研磨成匀浆，用2%草酸洗入100ml容量瓶中并定容，过滤，滤液备用以2,6-二氯酚靛酚溶液滴定呈粉红色，并在15s内不褪色为终点 试剂 2%草酸 标准VC(20ug/ml) 样品提取液ml 2,6-二氯酚靛酚燃料滴定ml 1空白 10 0 0 0.15 Y1 2染料标定ml 3染料标定ml 0 10 0 2.78V1 0 10 0 2.75V1 4样品ml 0 0 10 0.98Y0 5样品ml 0 0 10 1.02Y0 样品VC含量（mg/100g鲜重）=（YO-Y1）A/W *VT/VS *100 ； A=10ml*20/V1-Y1 *10-3 VT=100 ； VS=10 ；W=5 留神事项： 1. VC很轻易被恢复，研磨要快速，滴定也应操纵在2min以内； 2. 2,6-二氯酚靛酚很不稳定，每次测验时需重新测定浓度； 3. 若样品溶液有较多泡沫，可适当加丁醇 斟酌题： 1. 为什么在测定VC的同时要举行2,6-二氯酚靛酚溶液的标定？ 2,6-二氯酚靛酚溶液很不稳定。

2. 为了保证抗坏血酸含量切实测定，操作过程应留神些什么？ VC很轻易被恢复，需要快速研磨、快速匀浆、快速滴定，并要制止阳光直射，制止用铜、铁器具接触白萝卜并用2%草酸抑制酶活性，制止VC分解 3 测验四 植物硝酸恢复酶活性的测定—活体法 P126 原理：NR催化植物体内的硝酸盐恢复为亚硝酸盐产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生产红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定NR活性可由产生的亚硝态氮的量表示 材料：甘薯叶片 操作步骤：取2张不同的甘薯叶片，洗净后吸干水分，打孔后混匀，急速取0.3-0.4g样品3份于三角瓶中 30%三氯乙酸ml KNO3（磷酸缓冲液）ml 1（对照） 1 9 2（样品1） 0 9 3（样品2） 0 9 真空枯燥箱抽气10min→叶片下沉 恒温培养箱30℃暗处30min→酶促回响 30%三氯乙酸ml 540nmOD值 0 0 1 0.031 1 0.030 3份各取1ml于试管+2ml 1%磺胺+2ml 0.02%萘基乙烯胺，摇匀，显色15min，以1号管作参比，在540nm下比色。

样品中硝酸恢复酶活性[ug/(g.h)鲜重]=（X/VS）VT/WT X=OD值/k k=0.307；VS=1；VT=10ml；W=0.32；T=0.5h 留神事项： 1. 硝酸恢复酶易失活，操作应急速； 2. 硝酸盐恢复过程应在黑暗中举行，以防止亚硝酸盐恢复为氨，并严格操纵回响时间； 3. 从显色到比色时间要一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响 4. 取样宜在晴天举行，最好提前一天施用确定量的硝态氮肥，取样部位要一致 斟酌题： 1. 测定硝酸恢复酶的材料为什么要提前一天施用确定量的硝态氮肥，并且取样应在晴天举行？ 硝态氮肥即硝酸盐，硝酸恢复酶是诱导酶，硝酸盐诱导硝酸恢复酶的合成，为测验供给足量的酶 晴天植物举行光合作用，积累足够的NADH和碳水化合物（能量）供给回响 2. 测定硝酸恢复酶活性的离体法和活体法各有何特点？ 活体法：步骤简朴，适合快速、多组测定本测验不需外加NADH但重复性不好，受生物本身性质影响 离体法：步骤繁杂，但重复性较好，回响条件受人为操纵研磨易使酶失活，NADH在空气中易被破坏，要外加NADH。

3. 酶的诱导为什么要在暗处举行？ 亚硝酸盐在光照下易分解，叶绿素光合作用产生的一些辅酶会加快亚硝酸盐分解 4 测验五 淀粉酶活性的测定 P174 原理：淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等淀粉酶活力的大小与产生的恢复糖的量成正比可用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉生成的恢复糖的量，以单位质量样品在确定时间内生成的恢复糖的量表示酶活力萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，主要是α-淀粉酶、β-淀粉酶α-淀粉酶不耐酸，在PH3.6以下急速钝化；β-淀粉酶不耐热，在70℃保温15min那么被钝化 本测验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶的活力，再与非钝化条件下测定的总活力（α+β）对比，即可求出β-淀粉酶的活力 材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻 操作步骤：各取1g种子，低温置于研钵中+少量石英砂+2ml蒸馏水，研磨成匀浆，过滤后于100ml容量瓶，用蒸馏水定容，即为淀粉酶原液（酶液1）取原液10ml于50ml容量瓶，用蒸馏水定容，即为淀粉酶稀释液（酶液2）如下操作 酶液1 ml 钝化β-淀粉酶 酶液2 ml 3,5-二硝基水杨酸ml 预保温 1%淀粉溶液ml 40℃ 保温 3,5-二硝基水杨酸。