超嗜热古菌 Thermococcus spHJ21 产高温 α葡萄糖.doc

超嗜热古菌 Thermococcus sp.HJ21 产高温 α-葡萄糖苷酶条件和酶学性质初步研究杨磊 1,2，吕明生 2，王淑军 2,3，房耀维 2，刘姝 2，李华钟*1,41.江南大学教育部工业生物技术重点实验室，江苏无锡 (214122)2.淮海工学院江苏省海洋生物技术重点建设实验室，江苏连云港(222005)3.南京农业大学食品科技学院，南京(210095)4.江南大学医药学院，江苏无锡，(214122)E-mail: hzhli@摘 要：对一株分离自深海热液口的超嗜热古菌(Thermococcus sp. HJ21)菌株进行了产 α-葡萄糖苷酶条件的优化和酶学性质的初步研究结果表明：该菌株发酵时间为 6h 时，较适合 产胞内 α-葡萄糖苷酶，发酵时间为 21h 时较适合产胞外 α-葡萄糖苷酶其最适产酶温度为85℃，pH 为 6.5，NaCl 浓度为 2.5%可溶性淀粉、酵母粉和蛋白胨促进产酶该酶的最适 作用温度为 100℃，90℃半衰期（t1/2）为 2h最适酶作用 pH 值为 7.0，在 pH 值 5.0～8.0 之间酶活力相对稳定金属离子 Cu2＋、Al3＋、Ni2＋对该酶有较明显抑制作用，Hg2＋几乎完全 抑制该酶的活性，而 EDTA、Fe3＋和 K＋对该酶有激活作用。

关键词：嗜热古菌；Thermococcus；α-葡萄糖苷酶；酶学性质α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase E.C 3.2.1.20) 又称 α-转移葡萄糖苷酶(α-transglucosidase E.C 2.4.1.24)，可以从低聚糖类底物的非还原性末端切开 α-1,4 糖苷键，释放出葡萄糖，或将 游离出的葡萄糖残基以 α-1,6 糖苷键转移到另一个糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异 麦芽糖（IMO）、糖脂或糖肽等该酶既具有水解能力，又具有转移能力，α-葡萄糖苷酶糖 苷键水解和转移活性的特性可能由于酶结合和催化位点结构的不同引起的[1～3]α-转移葡萄 糖苷酶在自然界中分布广泛，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生物体内在人类的糖 原降解及动物、植物和微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能α-葡萄糖苷酶在淀粉加 工工业中可以用作糖化酶制剂，与 α-淀粉酶一起生产高葡萄糖浆另外，α-葡萄糖苷酶作为 工业化生产 IMO 的关键酶制剂备受国内外食品工业界的重视目前，国内研究主要集中在医药 α-葡萄糖苷酶抑制剂上，而对 α-葡萄糖苷酶性质和应 用方面研究报道较少，仅有 Thermus thermophilus、Aspergillus niger 等少数报道。

国外对 α- 葡萄糖苷酶研究较多，如 Pyrococcus furiosus、P. woesei、Sulfolobus shibatae、S. solfataricus、 Thermococcus zilligii 、 T.hydrothermalis 、 Thermotoga maritima 和 Thermoanaerobacter ethanolicus 等[4～9]我们对实验室保藏的一株来自深海热液口处的菌株 HJ21 进行了生理生化特征和 16S rDNA 的分析，初步鉴定为属于热球菌属 Thermococcus（另文报道），且发现该菌能产生高 温 α-葡萄糖糖苷酶，同时还可以产生高温的高温 α-淀粉酶[10]和普鲁兰酶本文主要报道该 菌产 α-葡萄糖糖苷酶的条件和酶学性质，不仅可为进一步酶基因的克隆和表达打下基础， 而且可望为今后与高温 α-淀粉酶一起在淀粉转化葡萄糖的工艺中一起发挥作用提供依据1 材料和方法1.1 菌株超嗜热古菌（Thermococcus sp.HJ21）由淮海工学院江苏海洋生物技术重点建设实验室本课题得到国家自然科学基金项目（40746030），江苏省“六大人才高峰” 第三批资助项目（06-A-017）和 江苏省教育厅自然科学基金项目（06KJB550004）的资助。

1 -保藏1.2 培养基改良 YPS 培养基（1000ml）： 100×trace minerals solution 10ml，1﹪CaCl2 ·H2O 5ml，100×N-P mixture 10ml，500×Fe EDTA solution 2ml，Resazurin solution 5ml，PIPE 3.35g，酵 母粉 3g，蛋白胨 3g，麦芽糖 5g，硫 5g，pH 6.51.3 培养基的制备和菌株培养方法培养基 121℃灭菌 20min ，加入硫和灭菌的麦芽糖，进行除氧处理 接种前加入5%Na2S·9H2O (w/v)并使之最终浓度为 0.025%，88℃反应 10min，培养基变为黄色时开始接种菌株用注射器以 5%接种量接入改良的 YPS 培养基，88℃培养 9 h[11]1.4 产酶条件的研究1.4.1 发酵时间对产酶的影响将菌株接入到 YPS 培养基中，在 88℃下静置培养 36h，每 3h 到 6h 取出测酶活力1.4.2 发酵温度对产酶影响将菌株接入到 YPS 培养基中，分别在不同温度（50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃）下进行产酶发酵试验，培养 9h 后取出测定酶活。

1.4.3 发酵培养基初始 pH 对产酶影响用 1mol/L 的 NaOH 或 HCl 将改良的 YPS 培养基的初始 pH 分别调至 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0，在 88℃培养 9 h，测定酶活1.4.4 培养基 NaCl 浓度对产酶的影响在培养基中加入 NaCl，使之终浓度（w/v）分别为 0、1%、2%、2.5%、3%、4%和 5%， 在 88℃培养 9h，测定酶活1.4.5 培养基碳氮源对产酶的影响去除培养基中的麦芽糖、蛋白胨和酵母粉，以 0.6%（w/v）的硫酸铵作氮源，分别在培 养基加入 0.5％的各种碳源（麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、马铃薯淀粉、果糖、乳 糖、蔗糖、纤维素）进行碳源对产酶的影响的发酵试验去除培养基中的蛋白胨、酵母膏， 分别加入 0.3％的各类氮源（蛋白胨、酵母膏、酵母粉、硝酸铵、硫酸铵、酪蛋白、尿素、 胰蛋白胨、鱼粉）进行氮源对产酶影响的发酵试验1.4.6 正交试验设计以蛋白胨、酵母粉、可溶性淀粉、时间和 NaCl 浓度为因素设计正交试验 L16（45），蛋 白胨、酵母粉和可溶性淀粉分别用 0.1%、0.3%、0.5%和 0.7%（w/v）四个水平，时间分别 取 18h、21h、24h 和 27h，NaCl 浓度分别取 1.5%、2%、2.5%和 3%（w/v）四水平进行试验。

1.5 酶学性质的研究1.5.1 酶的作用温度将酶分别在 50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃（水浴）和 110℃（高 压灭菌锅）温度下，缓冲液为用 pH 7.0 的磷酸钠缓冲溶液（50mmol/L），以 pNPG 作为底 物进行酶活测定 2 -1.5.2 酶的热稳定性取适量酶液（添加或不添加 Ca2+，终浓度 5mM）分别在不同温度（80, 90, 100℃）下保 温 4h，每隔 0.5 到 1h 取出一组样品，迅速置于 4℃冰箱内，待保温结束后统一在标准条件 下测定残余酶活，以未处理的酶液的酶活设为 100%1.5.3 酶的作用 pH 对酶活力的影响用不同 pH 的 40 mmol / L Brittion-Robinson 通用缓冲液[12]（40 mmol / L 磷酸-40 mmol/L 硼酸-40 mmol /L 乙酸，用 NaOH 调 pH）取代酶活测定方法中的缓冲液进行酶活测定1.5.4 酶 pH 稳定性酶在不同 pH 的 10 mmol/L 的 Brittion-Robinson 通用缓冲液中常温下 24 h 处理后，加 入 100 mmol /L、pH 7.0 缓冲液恢复 pH，然后在标准条件下测定残余酶活，以未处理的酶液 的酶活设为 100%。

1.5.5 金属离子和化学试剂对酶活力的影响 将金属离子和化学试剂与酶液混合，使其最终浓度分别达到 1.0mmol/L，5.0mmol/L，然后在 100℃下测酶活以未经金属离子和化学试剂处理的作对照（100％）1.6 粗酶液的制备培养 9h 的培养液用滤纸过滤除去硫元素，于 12000×g 离心 15 min，取上清液上清液 中缓慢加入硫酸铵至 65％饱和度，4℃过夜12000×g 离心 30 min，小心弃掉上清，用尽量 少的 25mmol/L pH7.5，Tris-HCl 溶液溶解沉淀，在同样的缓冲液中 4℃透析过夜后 10000×g 离心 10 min，上清即为粗酶液1.7 测定酶活方法α-葡萄糖苷酶活性分析用对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)作底物取 50μL pNPG（浓度为 10mmol/L）、200μL 适度稀释的酶液和 200μL 0.1mol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.0）于100℃水浴中保温 15min，立即加入 400μL 1mol/L 预冷的碳酸钠溶液中止反应并显色，用酶 标仪在 405nm 处测定吸光值酶活力单位定义：在上述分析条件下，每分钟催化产生 1μmol PNP 的酶量为一个活力单位[13]。

2 结果与分析2.1 产酶条件的研究2.1.1 发酵时间对产酶的影响胞内 α-葡萄糖苷酶是通过超声破碎法获得以最高酶活设为 100％，由图 1A 可知胞内 α-葡萄糖苷酶活在 3～6h 时，产酶量上升速度较快，到发酵 6h 时，即菌体生长到指数期后 期（图中未画出）产酶量最高，随时间增加，酶活力逐渐下降胞外酶在 3～21h 成上升趋 势，在 21～30h 时产酶较高，在 21h 时最高从产酶时间来看，胞内 α-葡萄糖苷酶在发酵 较短的时间内产生，胞外 α-葡萄糖苷酶需要发酵较长的时间；从产酶量来看，胞内酶产量 比胞外酶产量高所以，判断 T. sp.HJ21 主要产胞内 α-葡萄糖苷酶2.1.2 发酵温度对产酶影响在 85℃时 α-葡萄糖苷酶产量最高，在 75～90℃产酶量较高若温度过低，古细菌代时 周期加长，古细菌总量较低，直接影响酶产量；温度过高，古细菌不适或不能生长，产酶量 下降（见图 1B）2.1.3 培养基初始 pH 值对产酶的影响由图 1C 可以看出在 pH 6.0～7.5 之间产酶相对较高，在 pH6.5 时产酶量最高，这与初 始设计 pH 相同过低或过高的 pH 对产酶都有一定的影响。

2.1.4 培养基 NaCl 浓度对产酶的影响如图 1D 所示，NaCl 质量浓度对产酶影响比较显著不加 NaCl 时，不利于菌体生长， 几乎不产生酶，随 NaCl 浓度增加，产 α-葡萄糖苷酶的量也逐渐增加，当培养基 NaCl 质量 浓度为 2.5%时，产 α-葡萄糖苷酶最高，进一步升高 NaCl 浓度则会对菌体生长和 α-葡萄糖 苷酶酶活积累产生一定的抑制作用A相对酶活Relative activity/%100806040200相对酶活Relative activity/%B0 10 20 30 40 时间Time/h10080604020050 。