感染性疾病的分子诊断_图文

1、第八、九章 感染性疾病的分子诊断,感染的慨念,感染是病原体和人体之间的相互作用过程 病原微生物：致病菌（条件致病菌）,微 生 物,人 体,微 生 物,人 体,不 同 的 感 染 状 态,共 生 状 态,在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生,感染性疾病：由某种病原体所致，通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病。 病原体：病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、寄生虫 。,常规检测方法： 免疫学方法 微生物学方法 受敏感性、特异性限制，不易早期诊断，并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信息。,感染性疾病的分子诊断策略,一般性策略（检出病原体）： 判断有无感染 是何种病原体感染 常用方法：PCR 杂交 完整性策略： 检出病原体 分型（分类）亚型耐药性 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序,感染性疾病分子诊断标志物,病原体核酸分子（DNA/RNA） 基因表达产物 代谢物 免疫应答分子,二、感染性疾病分子诊断的常用方法,根据目的基因是否被放大， 可分为杂交法和扩增法。 信号放大技术检测方法 靶分子数目不变，而检测的探针信号放大 采用多酶、多探针或二者结合

2、等方法来增加探针标志物的浓度使检测信号得到放大。 靶分子扩增技术检测方法 靶分子（RNA、DNA或探针）的扩增 PCR、替代扩增、LCR等,图8-3 NASBA原理示意图,引物A 5端带有T7RNA聚合酶结合位点，3端碱基与靶RNA 3端序列互补;引物B的碱基序列与cDNA 3端序列互补,nucleic acid sequence-based amplification (NASBA),NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。,图8-3 NASBA原理示意图,引物A 5端带有T7RNA聚合酶结合位点，3端碱基与靶RNA 3端序列互补;引物B的碱基序列与cDNA 3端序列互补,nucleic acid sequence-based amplification (NASBA),NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。,三、感染性疾病分子诊断的标本处理,标本采集处理主要包括选择合适的标本种类、标本量

3、、抗凝剂等及对标本进行合适的传送、保存和预处理。,四、感染性疾病分子诊断的结果解释,1. 阴性结果 假阴性可能性 方法的灵敏度太低 方法失败 目标分子 2. 阳性结果 假阳性可能性 方法的特异性 受到污染,3. 定性检测结果 有时不能提供病原体活力相关信息 临床治疗病情缓解后一定时间内，在患者样本中仍可以检测出相应的病原体。 有些病原体潜伏在进体内，没有临床症状。 4. 疾病状况的判断 检测出病原体的存在并不能说此病原体就是引起疾病的直接原因。 该病原体可能是一种正常菌群,五、感染性疾病分子诊断的临床应用及评价,用于感染性疾病治疗的监控和预测、病情发展过程的危险性评价及疾病预后等。 耐药性的检测 细菌的分型 流行病调查,第一节 病毒的基因检测,人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、脑炎、流行性感冒等等，占人类传染疾病的75%左右。400多种不同病毒。 病毒结构：大 小：20-300nm 核心区：核酸（DNA或RNA） 外周衣壳：蛋白质 包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）,我国是HBV高流行区，50%70%的人受过感染，8%10%是HBV携带者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬变，H

4、BV又与原发性肝癌密切相关。 外壳（HBsAg): 外壳蛋白成分为表面抗原 核心（HBcAg)： DNA DNA 聚合酶 HBcAg,一、 乙型肝炎病毒,Dane颗粒（完整的病毒）形态,完整的乙肝病毒颗粒直径42纳米 由双层外壳和一个核心组成的，核心直径为27纳米， 内含DNA双链和DNA多聚酶,（一）病毒基因组结构,3.2kb双链DNA病毒 不完全双连环状DNA 长链L为负链：有4个开放阅读框S、C、P、X S区编码外膜蛋白（HBsAg） C区编码HBeAg 、HBcAg p区编码DNA聚合酶 X区位编码X蛋白，可能与病毒蛋白表 达有关。 短链S为正链：长短不一,pre-s1,pre-s2,S,P,C,pre-c,X,HBV DNA 3.2 kb,pre-S1 pre-S1蛋白 pre-S2 pre-S2蛋白 S HBsAg pre-C HBeAg C HBcAg P DNAP X HBxAg,HBV基因组结构,HBV 基因分型,HBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不同的基因型，至今为止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基因型： A型主要存在于白人， B型和C型主要存在

5、于亚洲人群 E型主要存在于西非 F型仅见于中南美洲的土著人 G型和H型很少见 不同基因型序列长度不同，主要是前S1区的不同。我国流行的主要是B和C基因型，长江以北以C型为主，长江以南以B型为主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有较高比例的D型,HBV在肝细胞内的复制,A(n),mRNA,cccDNA,HBsAg 包膜,负链DNA,包裹后的前基因 mRNA,传染性HBV 病毒颗粒,传染性HBV 病毒颗粒,部分双链 DNA,逆转录酶,DNA 聚合酶,肝 细 胞,（二）分子诊断,常用的免疫学检测方法，即二对半的检测存在窗口期，不易早期诊断。 1.PCR 采用普通PCR、FQ-PCR、竞争性PCR、免疫杂交PCR，可提供直接、准确的病原学诊断证据。引物是根据S、C、P、X基因中高度保守序列设计，决定扩增的特异性和敏感度。,扩增位置 引物序列 扩增片断（bp) P、X基因 5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3 278 5-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3 C基因 5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3 477 5-AAGCCCT

6、ACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3 C基因 5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3 258 5-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3,有时为了证实扩增产物的特异性，对扩增产物进行以下分析： RLFP 斑点杂交 Southern杂交,2. 支链DNA信号放大技术(bDNA）,原理: 捕获探针 检测 靶探针1 体系 靶探针2 bDNA分子:DNA主链上结 合多个侧链,捕获探针固化在微孔板上 靶探针1分别与捕获探针及待测核酸杂交 靶探针2分别与待测核酸及bDNA杂交 形成复合物：,固相支持物,捕获探针,靶探针1 CEs,待测核酸,靶探针2 LEs,bDNA复合物,分支链DNA信号放大技术(bDNA),信号检测：bDNA可结合很多酶标探针，酶催化底物（1,2-二恶二酮，dioxetane）发光，使核酸信号放大，且发光强度与DNA量成正比。 优点：放大倍数确定 阳性检出率高 稳定性和可重复性好 操作简便，省时，易于普及,3.基因芯片技术 标本经PCR扩增后与芯片上的特异探针进行杂交，可以检测： 是否有病毒感染 感染病毒的种

7、类及亚型 病毒的耐药情况 特点：可同时进行大量标本的检测,近年来陆续上市的核苷(酸)类似物对HBV的治疗压力集中在P区。,干扰素治疗对HBV的压力主要集中在前C/C区及前S区。,HBV耐药突变,lamivudine,adefovir,entecavir,telbivudine,YMDD (酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸),HBV对拉米夫定耐药是HBV DNA聚合酶突变所致。 耐药基因位点(YMDD)位于聚合酶的C区(rtM2041或rtM204V)，分别是YMDD中的蛋氨酸(M)被异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)所替代，形成YIDD或YVDD变异. 拉米夫定作用靶位为HBV DNA聚合酶C区。有研究表明，拉米夫定与HBV逆转录酶的亲和力与位于第552位氨基酸侧链长度有关，异亮氨酸和缬氨酸取代蛋氨酸，使侧链氨基酸长度缩短，使逆转录酶dNTP结合区增大，不适于拉米夫定结合，从而诱发耐药性。,HBV耐药检测（ YMDD突变检测方法）,YMDD突变检测方法,1. 基因测序法 2. 荧光定量PCR方法 基本原理 确定探针特定的TM值来区分是否突变 常用方法 覆盖突变位点荧光双探针杂交,YIDD

8、YMDD YVDD,46.91 54.64 50.74,（三）临床意义,1.早期诊断 免疫学检测敏感性： 0.1g/ml 核酸杂交检测敏感性：0.1pg/ml PCR检测： 0.1fg/ml 因此，在感染早期即可通过DNA检测证实病毒的存在。,2.监测治疗效果: HBVDNA107拷贝/ml提示病毒复制活跃； HBVDNA104拷贝/ml治疗有一定疗效； HBVDNA103拷贝/ml、HBeAg阴转、转氨酶正常为乙型肝炎临床治愈指标； 3.判断病情，指导制定合理的治疗方案,4.病毒耐药性的检测 乙肝病毒DNA聚合酶YMDD处的突变是病毒产生耐药性的重要原因，通过监测YMDD的突变情况，可以获得病毒耐药性方面的信息，指导抗病毒治疗。,二、 流行性感冒病毒 流行性感冒病毒(Influenza virus)，是引起流行性感冒的病原体; 分为甲(A)、乙(B)和丙(C)3个型别; 根据病毒颗粒表面血凝素(Haemagglutinin ，HA)和神经氨酸酶(Neuramiridase，NA)的抗原性，甲型流感病毒又可分为不同的亚型。 甲型流感病毒易发生变异，致病力强，1918年发生在西方国家的大

9、流感杀死了几千万人， 即是由甲型流感病毒引起。,There are 16 different H antigens (H1 to H16) and nine different N antigens (N1 to N9).,（一）流感病毒基因组结构 单链RNA病毒，RNA为负链； 有8个RNA片段或7个RNA片段； 所有RNA片段5末端和3末端高度保守； 两种不同亚型病毒感染宿主时，会生成基因重配的新病毒； RNA基因在复制过程中 常会发生点突变。,（二）分子诊断方法 可采用RT-PCR、FQ-PCR检测流感病毒RNA。引物常按流感病毒保守的非结构基因（NS）的序列进行设计。 为证实PCR扩增产物的特异性或提高检测的灵敏度，可用限制性内切酶分析法、斑点杂交法、Southern印迹法进行扩增产物的分析。,扩增位置 引物序列 扩增片段大小 NS基因 5-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3 190 (bp) 5-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3 NS基因 5-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3 241 (bp) 5-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3,（三）临床意义 流感病毒的诊断过去主要靠鸡胚羊膜腔培养和血清学血凝抑制试验，这些方法比较费时，灵敏度低，难以作出早期诊断。 PCR法敏感、特异、简便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病学调查。,三. 人类免疫缺陷病毒（HIV),HIV，human immunodeficiency virus AIDS，acquired immunodeficiency syndrome HIV为艾滋病的病原体。现已发现引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、

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