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HLA-B27检测参考课件

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常见问题

1、PCR SSP检测HLA B27 一实验目的掌握HLA基因分型的原理学习PCR SSP基因分型方法二实验原理编码HLA的基因具有高度的多态性每一个基因座位上有众多的复等位基因而每一个等位基因都有其各自的DNA序列因此可用相应的序列特异性引物 sequencespecificprimers SSP 进行扩增通过控制PCR反应条件特异性引物仅扩增与其相应的等位基因而不扩增其他的等位基因 1 实验步骤 PCR扩增琼脂糖凝胶电泳抽提DNA 2 PCR扩增的基本原理模板DNA的变性热变性模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离模板DNA与引物的退火复性模板DNA经加热变性成单链后温度降至55 左右引物与模板DNA单链的互补序列配对结合引物的延伸 DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以dNTP为反应原料靶序列为模板按碱基配对与半保留复制原理合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性退火延伸三过程 2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 3 PCR扩增体系模版DNA上游引物下游引物dNTP 原料缓冲体

2、系各种离子与水耐热的DNA聚合酶 4 PolymorphismintheMHCVariation 1 atasinglegeneticlocusinapopulationofindividualsEachpolymorphicvariantiscalledanalleleInthehumanpopulation over1 200MHCalleleshavebeenidentified MHCgenesarethemostpolymorphicknown 5 Polymorphicresiduesarelocatedintheantigen bindinggroove Variationinaminoacidsequenceschangestheshapeofthegroove 6 SchematicdiagramofclassIandclassIIMHCgenes mRNAtranscripts andproteinmolecules 7 EveryHLAallelehasitsownuniquesequences 8 Specificsequenceprimer SSP isd

3、esignedtobindtotheallelicsequencescomplementarily 9 SequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCR 10 SequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCR 11 三实验材料和方法1 血样 0 2mlEDTA抗凝血2 红细胞裂解液3 白细胞裂解液4 PCR混合液PCRbufferHLA B27SSPTaqdNTPinternalpositivereferenceprimers 12 HLA B27检测操作流程一 DNA的提取1 取1mlRBC裂解液入血样管中混匀裂解RBC 2 离心4000rpm 2min 3 重复步骤1 2两次最后用棉签吸干管壁液体 4 取100ulWBC裂解液入上述WBC管中混匀 5 将WBC管于60oC水浴消化20min 6 取出WBC管再于100oC 3 5min 灭活蛋白酶K 7 离心10000rpm 2min 上清即为富含DNA的PCR模板 13 二 PCR扩增1 吸2ul模板DNA入装有PCR混合液的小管中注意不要加到石蜡油层 2 将小管置于PCR仪内进行扩增需80min 12 23 预变性 94oC2min变性 94oC12sec复性 62 1min延伸 72 30sec变性 94oC12sec复性 58oC50sec延伸 72oC30sec37oC10sec HLA B27扩增程序 14 三电泳检测吸PCR产物10ul加到2 琼脂糖凝胶孔内将琼脂糖凝胶板置电泳槽内电泳160V 20min后取出观察结果 15 四结果观察 16 SpecificbandscanbeseenwithHLA B27 samples 17 HLA分型概述方法比较血清学分型细胞学分型基因分型应用移植配型疾病相关性研究法医学 18

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