螺旋藻激酶对大鼠动静脉环路血栓的溶栓作用研究

1、螺旋藻激酶对大鼠动静脉环路血栓的溶栓作用研究 作者：庞 辉，李小花，陈高斯，凌凯南， 王保斌，张崔勇，黄家俍，刘庆， 朱召熊，安明，蒙莲 【摘要】 目的探索螺旋藻激酶(SPK) 对大鼠动静脉环路血栓的溶栓作用及其机制。方法采用大鼠颈动-静脉环路血栓模型, 通过称取血栓重量来测定螺旋藻激酶的溶栓作用;腹主动脉取血分离血浆，测定螺旋藻激酶对血浆D二聚体、TPA含量的影响。结果螺旋藻激酶使动静脉环路血栓干、湿重明显减轻，高、低剂量螺旋藻激酶使血浆D-二聚体含量明显升高(P均<0.05)，高剂量螺旋藻激酶使TPA含量明显升高(P<0.05)。结论螺旋藻蛋白激酶能抑制血栓形成, 激活纤溶活性,具有较好溶栓效力。 【关键词】 螺旋藻蛋白激酶; 颈动静脉血栓形成; 血栓溶解血栓性疾病是临床常见病，严重地危害人们的健康，寻找具有抗凝和溶栓作用的物质对防治血栓性疾病具有广泛的临床实用价值。螺旋藻(Spirulina)是一种水生植物, 广泛分布于中国广西、福建、浙江、云南、海南等省区，具有增强免疫力、抗辐射、抗疲劳等药理作用，它现在已经被开发出具有多种功效的天然绿色保健品1。我们首先从螺旋藻的

2、发酵物中发现一种具有溶解纤维蛋白作用的蛋白激酶类活性成分，我们称它为螺旋藻激酶(SPK)，本试验主要使用螺旋藻激酶提取液观察它对大鼠动静脉环路血栓的溶栓作用及其溶栓机制，为开发廉价有效的治疗血栓性疾病的药物提供实验依据。1 器材与方法1.1 药品与试剂 肝素钠注射液(天津市生物化学制药厂061226);纤维蛋白原冻干粉(24mg广西医科大学实验中心蛇毒所研制)、凝血酶(由中国药品生物制品所提供), TPA含量测定试剂盒(上海太阳生物技术公司)， 尿激酶(丽珠集团丽珠制药厂，批号 国药准字H44020645，产品批号060701),其他均为国产分析纯。1.2 SPK粗酶提取物的制备按照螺旋藻激酶粉由北海市康福保健食品有限公司提供，经广西测试中心检测其蛋白激酶含量为6 000FU(活力单位)/g10 g粉剂溶于100 ml生理盐水的比例混匀，以3 000 r/min离心10 min，取一定体积上清液搅拌加入饱和硫酸铵溶液，然后以8 000 r/min低温离心20 min后，依次分别获得015% ，15%35% ，35%45% ，45%55% ，55%65%，65%75%饱和度的蛋白质沉淀，

3、用三蒸水溶解，倒入透析袋，置于冰箱中进行透析，除去硫酸铵，然后置于低温冷冻干燥机中干燥得各段盐析产物的粉剂。取各段盐析产物在琼脂糖-纤维蛋白平板上进行溶圈实验，取纤溶活性高的部分为SPK提取物。1. 3 动物与仪器Wistar大鼠，雌雄不拘,体质量300350 g，由广西医科大学实验动物中心提供。动物合格证号桂动许字(2000)第001号。主要仪器：电热恒温水浴箱(姜堰市天力医疗器械有限公司生产);电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂，型号：G2X-DH-40*4.5-BS);电子分析天平(sartorious公司生产，型号：BP190S 81136606);TDL 25 台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。2 方法2.1 大鼠动静脉环路血栓模型的制备及给药Wistar大鼠40只，随机分为4组，每组10只，即SPK高剂量组(1 mg/ml)、低剂量组(0.3mg/ml)，生理盐水阴性对照组及尿激酶阳性对照组(2 000l/ml)，大鼠以20%氨基甲酸乙酯0.5 ml /100 g腹腔麻醉，由股静脉按0.5 ml/100 g推药，参照文献制作动静脉环路血栓模型，分离右侧颈总动脉及左侧颈外静脉

4、，并将两根用肝素生理盐水(25 U/ml)处理的聚乙烯管分别插入颈总动脉及颈外静脉，在动-静脉旁路的连接管内插入一段长8 cm的钢丝，用药后40 min开放动脉静脉环路15 min，中断血流形成血栓2，3。2.2 动静脉环路血栓测定用药后40 min开放动脉静脉环路15 min，中断血流形成血栓后迅速取出包裹钢丝的血栓称重，并减去钢丝重量，即得血栓湿重，并求出其血栓抑制率。在70干燥箱中1 h后，待其冷却后称取干重，求出血栓抑制率2。2.3 血浆D二聚体和TPA含量的测定 腹主动脉取血及分离得到血浆，在广西医科大学第一附属医院检验科测定D二聚体含量，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆TPA的含量。2.4 统计学处理数据处理所测数据由作者采用SPSS10. 0软件经计算机处理,统计结果以s表示,组间差别显著性用t检验判定。3 结果3.1 SPK对大鼠动静脉环路血栓形成重量的影响结果显示，SPK有抑制动静脉环路血栓形成的作用，使血栓形成的湿重及干重明显减轻，与对照组比较有显著性差异，且呈量效依赖关系。结果见表1。表1 SPK对大鼠动静脉环路血栓形成重量的影响与生理盐水组比较，* P

5、<0.05;n=103.2 SPK对大鼠血浆D二聚体和TPA的含量的影响 结果显示，高、低剂量SPK均使D二聚体含量显著增加，高剂量SPK使TPA含量显著增加，且从数值上看，有剂量效应依赖关系。结果见表2。表2 SPK对大鼠D二聚体和TPA的含量的影响4 讨论螺旋藻激酶(SPK)是利用液体发酵的技术从螺旋藻生产出的蛋白酶，前期我们研究发现SPK有较高的溶栓活性。本实验我们验证其体内溶栓活性，实验结果表明SPK可抑制动静脉环路血栓，使血栓形成的湿重及干重明显减轻，与对照组比较有显著性差异，且呈量效依赖关系。血栓是血液中纤维蛋白多聚体与细胞组成的复合物，血栓溶解的中心环节在于纤维蛋白的溶解。纤维蛋白溶解分为两个基本阶段，第一阶段：纤溶酶原被纤溶酶原激活物激活为纤溶酶。纤溶酶原激活物(TPA)是内皮细胞合成的一种丝氨酸蛋白酶，在血栓形成时，TPA与纤维蛋白原形成复合物后在局部有效地激活纤溶酶原转化为纤溶酶而使血栓溶解4。本实验中，大鼠注射SPK溶液后，血浆TPA含量增加，且随着用药剂量的增加，其含量有递增趋势，说明SPK可以通过促进内皮细胞合成分泌TPA来促进纤溶作用;第二阶段：纤溶酶

6、分解纤维蛋白和纤维蛋白原为许多可溶性的小肽，称为纤维蛋白降解产物，而D二聚体为交联纤维蛋白降解的特异性分子标记物，为降解产物中的最小片段，是血栓被溶解的直接证据4,5。本实验制作大鼠动静脉环路血栓模型，大鼠注射SPK溶液后，血浆D二聚体含量明显增加，且随着用药剂量的增加有递增趋势，说明SPK可使血液系统的纤溶活性增强，使纤维蛋白溶解，特异性降解产物增多。综上所述SPK具有溶栓作用,但其溶栓作用的机制有待进一步研究，同时由于提取工艺不成熟,产品成分复杂，纯度低，作用效果尚不够稳定，也有待今后我们进一步进行分离提纯， 为开发价格更低、作用更显著，副作用更少更安全的新型溶栓药物提供了实验与理论联系实际依据。【参考文献】 1 秦文敏 ,田永云. 螺旋藻的药理研究进展J. 实用医技杂志, 2007,14(20):2830.2 陈 奇.中药药理研究方法学M.北京：人民卫生出版社,1994:571.3 陈 洲，黄自强，许建华，等. 葡萄球菌激酶对大鼠颈动脉血栓的溶栓作用J.血管康复医学杂志，2006,15 (1):33.4 汪世华，胡开辉，沙 莉，等. 溶栓酶的研究与开发J . 现代食品科技，2006，22(1)：174.5 Wang Shuai, Jia Ying. Examine vein thrombus with titer of D-D in blood plasmaJ. Chinese Journal Of the Practical Chinese with Modern Medicine, 2005, 18(2): 190. / 文档可自由编辑打印

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