伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能研究

1、伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能研究 作者：李君辉 罗哲 谢新民 李安平， 杜鸿 生秀梅 黄新祥【摘要】 目的： 探讨伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能。方法： 用载体pBAD介导回补uhpA至伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株，用qRTPCR观察cysM和treB基因表达，用表达载体pET22b原核表达UhpA蛋白，用凝胶阻滞试验观察UhpA蛋白与cysM和treB启动子区域DNA片段的结合。结果： 成功构建pBADuhpA重组质粒，在uhpA缺陷变异株中回补uhpA基因后，cysM和treB的表达明显恢复，但UhpAHis6蛋白与cysM和treB的启动子区域DNA片段无明显结合。结论: 伤寒沙门菌UhpA在高渗应激条件下能促进硫代谢及海藻糖代谢相关基因表达，且可能为间接作用。 【关键词】 伤寒沙门菌； UhpA； 凝胶阻滞； 基因表达调节Abstract Objective: To explore the function of the regulator UhpA in Salmonella enterica serovar Typhi. Methods： A recombinan

2、t plasmid pBADuhpA containing the uhpA gene with its own promoter was transferred into the uhpA deleted mutant of S.entericar serovar Typhi. qRTPCR was performed to observe the expression of cysM and treB. UhpA protein was expressed by a recombinant plasmid pET22buhpA in E.coli. The gel shift assays was performed to explore the combination between UhpA and the promoter region of cysM and treB.Results: Recombinant plasmid pBADuhpA was successfully constructed. After complementing uhpA gene in the

3、 uhpA deleted mutant, the expression of cysM and treB was obviously restored. Gel shift assays showed that UhpA protein could not bind the promote region of cysM and treB. Conclusion: At upshift high osmotic treatment, the UhpA may promote the expression of genes involved in the metabolism of sulfur and trehalose indirectly.Key words Salmonella enterica serovar Typhi; UhpA; gel shift assay; gene expression regulation 伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhi）是沙门菌属中一种人类严重的肠道致病菌，已成为一种重要的原核生物基因表达与信息调

4、控研究的模式菌1。沙门氏菌在感染的过程中，必须适应新环境（渗透压、酸性环境、巨噬细胞吞噬、抗菌肽等），对不同环境的调节主要由细菌多种双组分调节系统（twocomponent regulatory system)来介导2。目前在沙门氏菌和埃希菌（Escherichia coli）中已发现数十种双组分调节系统。 UhpB/UhpA作为一种双组分调节系统，调控转运蛋白UhpT的表达，从而有助于细菌利用外界环境中的6磷酸葡萄糖作为碳源或能量来源3。我们最近的基因芯片相关分析表明，uhpA基因缺陷变异株在高渗应激条件下相对于野生株有一系列基因的表达发生了明显的下调，而且这些基因大多与硫代谢相关。这提示在高渗应激条件，uhpA基因可能参与硫代谢途径的调控45。为了深入地研究UhpA的功能，我们在uhpA基因缺陷变异株中回补uhpA基因，通过qRTPCR观察其对下调基因表达的影响，同时表达UhpA蛋白，通过凝胶阻滞试验，分析UhpA对于硫代谢途径的相关基因是直接还是间接调控。 1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 菌株和质粒菌株：伤寒沙门菌野生株GIFU10007，uhpA-（伤寒沙门菌野生株GI

5、FU10007剔除uhpA基因），uhpA-（pBAD）（uhpA-含pBAD/g 质粒），uhpA-（pBADuhpA）（uhpA-含pBADuhpA）、大肠埃希菌E.coli DH5，E.coli TG1，E.coli JM109，E.coli JM109（pET22buhpA）（E.coli JM109含pET22buhpA） 质粒：pBAD/gIII，pET22b（两质粒用于蛋白表达，Amp抗性），pBADuhpA（pBAD/g含uhpA基因及其启动子区域），pET22buhpA（pET22b含uhpA基因）1.1.2 主要试剂限制性核酸内切酶BamH ，Sal，Nco，T4 DNA连接酶，ExTaq，pfuTaq，无RNA酶的DNA酶，TA克隆试剂盒均为TaKaRa（大连）公司产品；琼脂糖，胶回收试剂盒均为Promega公司产品；蛋白纯化系统，总RNA提取试剂盒为Qiagen公司产品；反转录试剂盒SuperScript（Invitrogen公司）；GSM缓冲液根据相关文献配制6。1.1.3 主要仪器PCR扩增仪2700(ABI)；凝胶成像系统Gene Genius Bioim

6、aging System(BioRad)； 电转化仪Gene Pulsero II(BioRad)；核酸检测仪Spectrophotometer ND1000（NanoDrop）；荧光定量PCR仪（Corbett）；垂直平板电泳仪（BioRad）。1.1.4 引物合成本文所用引物均由上海生工生物技术公司合成，引物序列见表1。表1 引物序列（略）1.2 方法1.2.1 uhpA缺陷变异株中回补uhpA基因分别在uhpA基因上、下游设计引物Fa与Fb并在5端加Nde, Xho酶切位点，以伤寒沙门菌野生株基因组DNA为模板，用高保真DNA聚合酶pfu扩增目的基因，将纯化后的PCR产物与载体pBAD/g同时用Nde, Xho双酶切，酶切产物用酚仿-乙醇法纯化后用T4 DNA连接酶22过夜连接。连接产物用热休克法转化至大肠埃希菌TG1，筛选疑似阳性克隆并用Nde, Xho双酶切和PCR分析鉴定，并经基因序列分析验证（由上海英骏生物技术公司完成）。将构建成功的重组载体pBADuhpA转入uhpA缺陷变异株，将其命名为uhpA回补株uhpA-(pBADuhpA），同时将空pBAD/g载体导入uhpA

7、缺陷变异株作为对照株uhpA-（pBAD）。1.2.2 细菌培养及总RNA提取挑取S.Typhi GIFU10007，uhpA-（pBADuhpA）和uhpA-（pBAD）单菌落接种于1 ml等渗LB培养液中，37振荡（250 r/min）培养过夜，以1100分别转接于20 ml等渗LB培养液中，LB培养液中均加入了0.2%的L阿拉伯糖，37振荡（250 r/min）培养4 h至对数生长期，再加入终浓度为300 mmol/L的NaCl培养30 min。冰上放置15 min后离心（4 000 r/min，10 min，4）收集菌体。用总RNA提取试剂盒提取细菌总RNA，并用无RNA酶的DNA酶（37 20 min，80 15 min）消化残量DNA。用核酸检测仪检测RNA浓度，同时取1 l进行琼脂糖凝胶电泳，分析RNA的质量。-70保存RNA备用。1.2.3 qRTPCR采用上述方法提取和处理细菌总RNA，取4 g总RNA，用N8随机引物，按照反转录试剂盒操作进行反转录。从筛选的差异表达基因中，选取2个差异基因，用特异性引物进行qRTPCR，观察基因表达。qRTPCR采用SYBR Gre

8、en并按文献6进行，用基因组DNA梯度稀释制作相应的标准曲线，据样品测定的初步结果确定标准品浓度范围。采用基因特异性引物进行扩增，扩增产物长度cysM为265 bp，treB为290 bp，序列信息见表1。1.2.4 UhpA蛋白的表达纯化分别在uhpA基因上、下游引物的5端加上Nde和Xho酶切位点，去除基因本身的终止子，利用载体上His6后面的终止子，使表达的UhpA蛋白C末端带有His6标签。以伤寒沙门菌野生株基因组DNA为模板，用高保真DNA聚合酶pfu扩增目的片段，将纯化后的PCR产物与回补载体pET22b同时用Nde，Xho双酶切，酶切产物用酚仿-乙醇法纯化后，用T4 DNA连接酶22过夜连接。连接产物用热休克法转化至大肠埃希菌TG1。提取疑似阳性克隆的质粒，用Nde，Xho双酶切和PCR分析鉴定，并经DNA序列分析验证（由上海英骏生物技术公司完成）。将构建成的重组质粒转入大肠埃希菌JM109。挑取重组质粒转化株单菌落接种于1 ml等渗LB培养液中，37振荡（250 r/min）培养过夜，以1100分别转接于20 ml等渗LB培养液中，37振荡（250 r/min）培养4

9、h至对数生长期。加入终浓度为0.01 mmol/L的IPTG，26振荡（250 r/min）培养8 h，离心（4 000 r/min，10 min，4）收集菌体，加入裂解液并用超声破菌，取上清用镍柱按产品说明纯化UhpA蛋白。1.2.5 凝胶阻滞试验据NCBI公布的伤寒沙门菌Ty2基因组序列信息，设计特异性引物cysD，treB，设计引物位置为转录起始点上游约250 bp，下游约50 bp，总长度约300 bp，以伤寒沙门菌GIFU10007为模板，扩增出cysD基因以及treB基因启动子区域。用酚仿乙醇法纯化PCR产物，取12 g PCR产物与不同浓度的UhpA蛋白混合，加入相应体积的GSM缓冲液，使三者反应总体积为20 l，30孵育15 min。选取198 bp的真核生物PCR产物作为阴性对照，8%的丙烯酰胺胶电泳分离条带，溴化乙啶染色8。 2 结果 2.1 uhpA回补株的构建 为进一步研究UhpA功能，本研究在uhpA缺陷变异株中回补uhpA基因，以伤寒沙门菌野生株基因组DNA为模板，用特异引物扩增目的片段，全长841 bp，包括uhpA的启动子，编码区域及终止子。将纯化后的扩增产物与载体pBAD/g定向连接，构建成pBADuhpA重组质粒。DNA序列分析显示重组区域无碱基突变，表明pBADuhpA重组质粒构建成功。进而将pBADuhpA重组质粒和空质粒pBAD/g分别导入uhpA缺陷变异株，构建成uhpA回补株和对照株。 2.2 qRTPCR分析cysM和treB基因的表达 本研究选取半胱氨酸合成酶编码基因cysM和6磷酸海藻糖水解酶编码基因treB作为代表，用qRTPCR观察分析U

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