第三章 发酵培养基

1、本章内容本章内容n常用培养基的基本要求常用培养基的基本要求n培养基的成分及来源培养基的成分及来源n培养基的类型与区别培养基的类型与区别n发酵培养基的设计原理与优化方法发酵培养基的设计原理与优化方法培养基培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖 所需的一组营养物质和原料。所需的一组营养物质和原料。发酵培养基的作用：发酵培养基的作用：满足菌体的生长满足菌体的生长 促进产物的形成促进产物的形成培养基的共性 单位培养基能够产生最大量的目的产物；能够使目的产物的合成速率最大；能够使副产物合成的量最少；所采用的培养基应该质量稳定、价格低廉、长期易于获得；所采用的培养基尽量不影响工业好氧发酵中的通气搅拌性能以及发酵产物的后处理等。一、发酵工业培养基的基本要求 发酵工业培养基：是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。一般设计适宜于工业大规模发酵的培养基应一般设计适宜于工业大规模发酵的培养基应遵循以下原则：遵循以下原则：n（1）必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分；n（2）有利于减少培养基原料

2、的单耗，即提高单位营养物质的转化率；n（3）有利于提高产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力；n（4）有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期；n（5）尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化；n（6）原料价格低廉，质量稳定，取材容易；n（7）所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗；二、培养基的成分及来源二、培养基的成分及来源组成：碳源、氮源、水、无机盐、生长因子、能源。碳源主要功能：一是提供微生物菌体生长繁殖所需的能源以及合成菌体所需的碳骨架；二是提供菌体合成目的产物的原料。常用：糖类、油脂、有机酸和低碳醇等。1糖类：发酵培养基中使用最广泛的碳源。纯糖 天然原料木糖木糖单糖：单糖：葡萄糖葡萄糖双糖：双糖：蔗糖、麦芽糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖乳糖 多糖：多糖：淀粉、糊精淀粉、糊精 及其水解液及其水解液糖糖 蜜蜜 类：类：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜糖糖 类：类：麦芽汁麦芽汁淀粉质类：淀粉质类：山芋粉、马铃薯粉、山芋粉、马铃薯粉、玉米粉、燕麦粉、玉米粉、燕麦粉、木薯粉木薯粉其其 它：它：纤维素水解液、乳清纤维素水解液、乳清碳源物质的易利用顺序：碳

3、源物质的易利用顺序：(单单)葡萄糖葡萄糖(双双)蔗糖、麦芽糖、乳糖蔗糖、麦芽糖、乳糖(多多)糊精糊精淀淀粉粉1.1葡萄糖常作为培养基的一种主要成份，并且作为加速微生物生长的一种速效碳源。但要注意葡萄糖效应。p“葡萄糖效应”是研究大肠杆菌利用各种不同混合碳源的时发现的碳分解产物的阻抑作用。当大肠杆菌培养于含有葡萄糖和乳糖的培养基中，菌体出现两次生长旺盛期。葡萄糖效应葡萄糖效应1.2糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。糖蜜常用在酵母发酵和抗生素生产过程中作为碳源。在酒精生产工业中若用糖蜜代替甘薯粉，则可省去蒸煮、糖化等过程，简化了酒精生产工艺。糖蜜使用的注意点：糖蜜使用的注意点：除糖份除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵例：谷氨酸发酵有害物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）有害物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）生物素（发酵控制）预处理：澄清预处理：澄清脱钙脱钙脱除生物素脱除生物素例：柠檬

4、酸发酵例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）1.3淀粉等多糖也是常用的碳源，它们一般都要经过菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利用，但通常也有将其经过液化和糖化后再作为培养基的碳源使用。使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。缺点：难利用、发酵液比较稠、成分比较复杂，缺点：难利用、发酵液比较稠、成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格低、可以解除葡萄糖效应。优点：来源广泛、价格低、可以解除葡萄糖效应。2油和脂肪脂肪酶作用 水解成甘油和脂肪酸 进一步氧化成CO2和H2O，并释放出比糖类碳源代谢多得多的能量。缺点：比糖类代谢需要更多的氧。3有机酸 有机酸的利用常会使发酵体系pH上升。CH3COONa+2O2 2CO2+H2O+NaOH4烃和醇类 近年来随着石油工业的发展，烷烃(一般是从石油裂解中得到的1418碳的直链烷烃混合物，以及甲烷、乙烷、丁烷等)用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和酶制剂的工业发酵中。n氮源的种类 无机

5、氮源无机氮源 有机氮源有机氮源氨基氮：氨基氮：NH4OH (NH4)2SO4 NH4NO3 NH4 Cl硝态氮：硝态氮：NaNO3 KNO3 合成产物：尿素合成产物：尿素天然原料：天然原料：植物蛋白：黄豆饼粉、花生饼粉、植物蛋白：黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、菜籽饼粉、棉籽饼粉、菜籽饼粉、麦麸、麦麸、玉米浆、玉米麸质粉玉米浆、玉米麸质粉 动物蛋白：蛋白胨、鱼粉、动物蛋白：蛋白胨、鱼粉、蚕蛹粉、牛肉膏蚕蛹粉、牛肉膏 微生物蛋白：酵母粉微生物蛋白：酵母粉/浸膏、浸膏、废菌丝粉废菌丝粉 其它：酒糟等其它：酒糟等工业上常用的有机氮源都是工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料或副产品。一些廉价的原料或副产品。氮源 氮源主要用于构成菌体细胞物质和合成含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。1 有机氮源 由于有机氮源营养丰富，因而微生物在含有机氮源的培养基中常表现出生长旺盛、菌丝浓度增长迅速等特点。1.1玉米浆 是玉米淀粉生产中的副产物，是一种很容易被微生物利用的良好氮源。pH在4.0左右。1.2尿素 成分单一，主要用于青霉素和谷氨酸生产。有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行

6、影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响2无机氮源 常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。微生物对它们的吸收利用一般较快尤其是铵盐氨水等比有机氮源的吸收要快得多，所以也称之为速效氮源。无机盐及微量元素无机盐及微量元素1、作用：各种不一样。、作用：各种不一样。2、来源：来源：C、N源，以盐的形式补充。源，以盐的形式补充。3、用量：根据具体的产品，以实验决定。用量：根据具体的产品，以实验决定。4、使用注意点使用注意点A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑。微量元素在发酵过程中必须加以考虑。例：铁离子例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理。发酵罐必须进行表面处理。B、使用时注意盐的形式（使用时注意盐的形式（pH的变化）的变化）例例：黑黑曲酶曲酶NRRL-330,生产生产-淀粉酶，淀粉酶，pH对酶活的影响对酶活的影响 pH 酶活酶活不加不加 4.25 120分钟分钟加

7、加 K2HPO4 5.45 30分钟分钟加加 KH2PO4 4.62 75分钟分钟无机盐及微量元素 1磷 磷是核酸和蛋白质的必要成份，也是重要的“生命通货”三磷酸腺苷（ATP）的组成成份。在代谢途径的调节方面，磷元素起着很重要的作用，磷元素有利于糖代谢的进行，因此它能促进微生物的生长。但磷若过量时，许多产物的合成常受抑制。2镁 镁处于离子状态时，则是许多重要酶的激活剂，镁离子不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成。3硫 硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成份和某些辅酶的活性基。4铁 铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成份，因此铁是菌体有氧氧化必不可少的元素。（为什么在培养基中一般见不到）5氯 氯离子在一般微生物中不具有营养作用，但对一些嗜盐菌来讲是必需的。6钠、钾、钙 钠离子与维持细胞渗透压有关，故在培养基中常加入少量钠。钾离子也与细胞渗透压和透性有关，并且还是许多酶的激活剂，它能促进糖代谢。钙离子主要控制细胞透性。水水 对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。不同

8、水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。水源质量的主要考虑参数包括水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。体、污染程度以及矿物质组成和含量。对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。生长调节物质 发酵培养基中某些成份的加入有助于调节产物的形成，这些添加的物质一般被称为生长辅助物质，包括生长因子、前体、产物抑制剂和促进剂。生长因子 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。有机氮源是生长因子的重要来源。前体 前体指加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因其加入而有较大提高的一类化合物。用法用法：前体使用时普遍采用流加的方法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添

9、加苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化；氧化；流加也有利于提高前提的转化率流加也有利于提高前提的转化率产物合成促进剂 所谓产物合成促进剂，是指那些细胞生长非必需的，但加入后却能显著提高发酵产量的一些物质，常以添加剂的形式加入发酵培养基中。促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。三、培养基的类型与区别培养基的类型与区别n1斜面培养基 要求：能使菌体生长快，产生孢子数量大、质要求：能使菌体生长快，产生孢子数量大、质量好，且不会引起菌种变

10、异。量好，且不会引起菌种变异。特点特点C、N源不宜多，否则只长菌丝，少长或不源不宜多，否则只长菌丝，少长或不长孢子；长孢子；无机盐浓度要适当控制，否则会影响孢子的无机盐浓度要适当控制，否则会影响孢子的颜色和孢子量。颜色和孢子量。n2种子培养基 n要求要求n营养丰富、完全，氮和维生素的含量高些；营养丰富、完全，氮和维生素的含量高些；n培养基中加入一些易于吸收利用的快培养基中加入一些易于吸收利用的快C、N源，便于孢子发芽生长；源，便于孢子发芽生长；npH要稳定；要稳定；n最后一级尽可能接近发酵培养基，常加入少最后一级尽可能接近发酵培养基，常加入少量发酵合成期才大量需要的物质。量发酵合成期才大量需要的物质。n3发酵培养基 n目的：使接种菌丝生长并能高效表达，获得高的发酵产量，同时组分尽可能单一，以保证高的得率。n要求n营养丰富完全，有利于产物合成；n不能大量加入快C、快N源，应和慢C、N源相结合；n在产物分泌期间，pH 稳定；n加入适量合成所需的物质，如前体等，进行定向发酵；n采用中间补料，以提高发酵单位；n原料的考虑成本问题第四节第四节 培养基的设计与筛培养基的设计与筛选选n问题来了！问题

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