共聚焦显微镜原理
4页1、激光共聚焦显微镜的构件与原理一、主要构件:一个完整的激光扫描共聚焦显微镜 (Laser Scanning ConfocalMicroscope, LSCM)系统由几个主要的硬件和一些成像分析软件组成。硬件包括 表面荧光显微镜、激光光源及冷却系统、定位扫描装置、分辨系统、计算机控制 系统、显示器和图像输出打印设备,软件由三维图像分析系统和三维图像文件管 理系统构成。1、Illuminating pinhole:照明针孔功能:使激光经过照明针孔后形成点光源,点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与detectorpinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。2、Objective:物镜3、Focal plane焦平面功能:激光点光源照射物体在焦平面处聚焦,激发荧光标记的样本发射荧光,形 成焦点光斑。该光斑经过 objective、beamsplitter等一系列装置的处理,分别在 illuminating pinhole及detector pinhole两处聚焦。共聚焦的含义由此而来。4、Detector pinhole探测器针
2、孔功能:与 beamsplitter作用类似,起到空间滤波器的作用。最大限度的阻碍非聚焦 平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光以保证探测器针孔所接受到的 荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置,因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔 成像光斑包含相同信息(两点共轭)。5、PMT :光电倍增管(探测器)功能:接受通过针孔的光信号,转变为电信号传输至计算机,在屏幕上出现清晰 的整幅焦平面的图象。6激光器我们可以根据研究需要选择不同的激光器。ArUV(351、364nm),AR(457、488、514nm),HeNe(543、633nm)等二、基本原理:传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰。激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源,点光源照射标本,在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点, 该点被照射后发出的 荧光被物镜收集,并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔, 分别称为照明针孔和探 测针孔。两者的几何尺寸一致,约100-20Onm;相对于焦平面上的光点,两者是 共轭的,即
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