非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)解析

中国药典2015年版非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)解析杨晓莉陕西省食品药品检验所2015年08月16日目标药品微生物控制是药品安全性保障的重要措施。欧、美、日等主要药典均收载了协调一致的微生物限度检查法及限度标准，由于历史原因，我国目前的微生物限度检查体系与国际相比存在差距，这一差距对于目前我国企业产品出口造成很大的障碍，也对我国的微生物质量控制造成很大困惑。中国药典2015年版修订的总体目标：“中药引领国际发展，化学药品与国际接轨”。主要内容12格式和通用要求变化培养基适用性检查3计数方法适用性试验供试品检查456结果判断新理念主要内容1格式和通用要求变化格式变化结合国情 国际同步USP35中国药典2010版中国药典2015版非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）MicrobiologicalExamination ofNonsterile Products:Microbial EnumerationTests附录 C/附录J：微生物限度检查法XI非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）附录 C/附录 XIJ：微生物限度检查法MicrobiologicalExamination ofNonsterile Products:Tests for SpecifiedMicroorganismsMicrobiologicalAttributes of NonsterilePharmaceutical Product附录 C/附录 XIJ：微生物限度检查法非无菌药品微生物限度标准（通则1107）格式变化中国药典2010年版微生物计数法编排方式中国药典2015年版微生物计数法编排方式内容变化中和剂、灭活剂通用要求变化适用范围2010版2015版系检查非规定灭菌制剂 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的及其原料、嗜温细菌和真菌的计数。辅料受微生物污染程度的方法 明确规定本法不适用于活菌制剂的检查。增加了检测产品的范围。通用要求变化适用范围原核细胞：细菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、蓝细菌和古细菌真核细胞：酵母菌、霉菌、粘菌、原生动物和藻类微生物无细胞结构：病毒、噬菌体、类病毒、拟病毒和朊病毒备注：即除细菌、真菌外其它微生物也需要关注其有害性。通用要求变化检测环境变化微生物计数试验环境要求微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防治污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流区域、工作台面及环境应定期进行监测。（第三公示稿）9203：药品微生物实验室质量管理指导原则“微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行”。9205：药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则用于指导药品微生物检验用的洁净室等受控环境微生物污染情况的检测和控制。通用要求变化试剂和试药试剂和试药中和剂、灭活剂和表面活性剂均应对微生物无毒性，其相互间具有相容性，有利于样品中微生物均匀分散。稀释液1、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；2、pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.2无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液；如需要，可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。3、0.9%无菌氯化钠溶液。通用要求变化培养基对照培养基 按标准物质管理，由中检院负责研制分发。培养基适用性试验 2皿（0.52.0），2管（生长良好）。通用要求变化培养基计数用培养基a.需氧菌总数：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）b.霉菌和酵母菌总数：沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）,玫瑰红钠琼脂培养基或含抗生素的SDA。通用要求变化-计数的方法2010版2015版1.平皿法：包括倾注法和涂布法。该项下明确可使用直径较大平皿，且培养基的用量应相应增加。2.薄膜过滤法。3.1.平皿倾注法2.薄膜过滤法MPN)。MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。注：方法选择原则：根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择。平皿法之倾注法与涂布法通用要求变化-计数的方法平皿法之倾注法与涂布法比较倾注法涂布法将培养基冷却后，加一定量的菌液，用涂布器均匀涂布后，待菌液被渗透吸收，倒置培养。先加一定量的菌液，然后加入培养基，混匀冷却后倒置培养。操作 培养基表面适宜好氧菌，内部适宜 培养基适合好氧菌培养。兼性厌氧菌培养。操作较繁琐，增加污染几率。一次接种量不少于0.1ml样品。特 操做方便快捷。点 接种量为1ml或更多样品。不可使用预制培养基。计数不准确，涂布器会沾少许微生物。可以使用预制培养基。通用要求变化-计数的方法薄膜过滤法微生物检测用滤膜孔径不大于0.45m，直径50mm，总冲洗量不超过1000ml。通用要求变化-计数的方法MPN法最可能数法的精确性不及平皿法和薄膜过滤法，不适宜霉菌及酵母菌计数，该法适用于某些含菌量较低的供试品需氧菌总数测定。因此，该法仅在没有其他方法可供选择的情况下，作为需氧菌总数计数法。增加方法例如食品安全国家标准GB 4789.3-2010中大肠菌群的MPN计数法，其优点在于少量菌在经过增菌后进行直接观察结果，通过查表得到计数结果。通用要求变化菌种及菌液制备 表1试验菌液的制备和使用项下包括：试验菌株、试验菌液的制备方法、计数培养基适用性检查以及计数方法适用性试验。通用要求-菌种及菌液制备2010版2015版试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。目前均使用CMCC。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28，在验证过的贮存期内使用。通用要求菌种及菌液制备9203：药品微生物实验室质量管理指导原则菌种药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株。标准菌株的复苏、复壮或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。工作菌株不可替代标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。标准菌株如果经过确认试验证明已经老化、退化、变异、污染等或该菌株已无使用需要时，应及时灭菌销毁。通用要求菌种及菌液制备菌种编号 CMCC 中国医学菌种保藏中心CMCC（B）或 CMCC（F）B 代表细菌、F 代表真菌 ATCC 美国标准菌种收藏中心著名的微生物保藏中心，创立于1899年，设在美国马里兰州罗克维尔市。收藏有细菌、真菌、动植物病毒、噬菌体、藻类和原生生物等共计16000株以上的微生物种株。通用要求菌种及菌液制备.菌种的保藏原则：低温、干燥、缺氧、缺营养环境抑制微生物的代谢和生长繁殖。.各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切实可行、快速稳定的菌液制备SOP。通用要求菌种及菌液制备菌株中国药典协调案枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisCMCC(B)63501 ATCC6633及其他CMCC(B)26003 ATCC6538及其他金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosaCMCC(B)10104ATCC9027及其他大肠埃希菌Escherichia coliCMCC(B)44102 ATCC8739及其他CMCC(F)98001 ATCC10231及其他CMCC(F)98003 ATCC16404及其他白色念珠菌Candida albicans黑曲霉Aspergillus niger通用要求菌种及菌液制备2010版2015版铜绿假单胞菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉 杆菌、白色念珠菌、黑曲霉大肠埃希菌是发酵的革兰阴性短小直杆菌，兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，常有光滑型、粗糙型和粘液型。铜绿假单胞菌为非发酵革兰阴性杆菌，属专性需氧菌，菌落形态较为一致，并产生水溶性色素。主要内容12格式和通用要求变化培养基适用性检查培养基适用性检查2010版2015版1.胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤用于需氧菌总数测定。2.沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌和酵母菌总数测定。1.营养琼脂用于细菌计数。2.玫瑰红钠琼脂用于霉菌和酵母菌计数。3.含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂或其他选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂）。3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂用于酵母菌计数。4.菌液制备用稀释液：0.9氯化钠溶液4.菌液制备用培养基：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液。培养基适用性检查营养琼脂培养基与胰酪大豆胨琼脂培养基检出菌落总数的比较细菌数（cfu/g）霉菌及酵母菌数（cfu/g）样 编品 号普通营养 胰酪大豆胨 玫瑰红钠琼脂沙氏葡萄糖琼脂琼脂琼脂1560011600101010101010XXXX丸23451011010901010101045001101010备注：培养基应具备广谱性，有助于产品中所有存活微生物生长。培养基适用性检查2010版2015版1.胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色1.营养琼脂：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆 念珠菌、黑曲霉。菌。2.胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、2.玫瑰红钠琼脂：白色念珠菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌。黑曲霉。3.沙氏葡萄糖琼脂、玫瑰红钠琼脂：白色念珠菌、黑曲霉。培养基适用性检查2015版需氧菌总数：2010版细菌数：营养琼脂胰酪大豆胨琼脂3035，48小时3035 细菌不大于3days真菌不大于5days霉菌及酵母菌数：玫瑰红钠琼脂霉菌和酵母菌总数：沙氏葡萄糖琼脂/玫瑰红钠琼脂2025 不大于5 days2328，72小时培养基适用性检查培养条件嗜热型微生物最适生长温度为4558；嗜温型为2543；嗜冷型为1018。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌最适生长温度为37，白色念珠菌和黑曲霉最适生长温度为28，均为嗜温型微生物。培养基适用性检查2010版2015版微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。范围 固体培养基加菌量 50100cfu不大于100cfu营养琼脂：3035玫瑰红钠琼脂：2328胰酪大豆胨琼脂/胰酪大豆胨肉汤：3035沙氏葡萄糖琼脂/玫瑰红钠琼脂：2025培养温度培养 细菌：48h时间 真菌：72h细菌不超过3天；真菌、黑曲霉不超过5天。判定标准固体培养基：0.52（50200）液体培养基：生长良好。70培养基适用性检查培养基适用性检查示例名称胰酪大豆胨琼脂培养基取已灭菌胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，注入直径90mm的无菌平皿中，于3035培养3天。阴性对照金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉试验用菌株接种方法涂布法：分别接种不大于100cfu试验用菌悬液于胰酪大豆胨琼脂平皿上；倾注法：分别接种不大于100cfu试验用菌悬液于直径90mm的无菌平皿中，倾注约1520ml培养基，轻轻摇匀。适用性检查：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌于3035培养不超过3天；白色念珠菌、黑曲霉于3035培养不超过5天。与对照培养基比较，比值在0.52范围内，且菌落大小、形态一致。判断标准阴性对照：3035培养35天无菌落生长。培养基适用性检查示例名称胰酪大豆胨液体培养基取已灭菌的胰酪大豆胨液体培养基，于3035培养3天，观察其是否变浑浊。阴性对照试验用菌种 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌试验用菌接种方法判定标准悬液于该培养基中，接种量不大于100cfu，摇匀。适用性检查：3035培养不超过3天，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌接种后与对照培养基比较，试验菌应生长良好。（建议：培养基呈混浊的液体，或划线于相应的分离平板上，培养后呈现典型菌落）阴性对照：3035培养不少于3天，培养基呈澄清的液体。培养基适用性检查示例名称沙氏