娄加陶-ct-DNA在肺癌个体化诊断运用之路 上海市胸科医院

ct-DNA在肺癌个体化诊断之路娄加陶上海市胸科医院循环肿瘤DNA(Circulating Tumor DNA,ctDNA)来源：1、坏死的肿瘤细胞；2、凋亡的肿瘤细胞；3、循环肿瘤细胞；4、肿瘤细胞分泌的外排体。特点：肿瘤细胞释放到血浆中的单链或双链DNA；携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变 突变 缺失 插入 重排 拷贝数异常 结构变异 甲基化 具有对癌变组织的代表性，克服肿瘤组织异质性问题Nat Rev Cancer.2017 Apr;17(4):223-23液体活检的时代来临：ctDNA成为肿瘤治疗中的有力补充手段首次描述了游离核酸存在于人的血液中，但在肿瘤领域并未引起关注液体活检时代的来临：ctDNA的临床实践癌症患者血液中检测到重要癌基因RAS变异，ctDNA的重要性得到关注ctDNA精准医疗里程碑Genomics Proteomics Bioinformatics 15(2017)59-72ctDNA的特点 片段短（180-200bp）含量极低 1 ml血液中只有十几纳克（ng）的血浆游离DNA（cfDNA）。ctDNA只占cfDNA很小的比例（0.01%-1%）。含量与肿瘤类型、肿瘤负荷和肿瘤进展等相关。Trends Genet.2016 Jun;32(6):360-71.半衰期短（2小时）Nat Rev Clin Oncol.2013 Aug;10(8):472-84.Nat Med.2008 Sep;14(9):985-90.临床样本中ctDNA的分布特点ctDNA在很多肿瘤中都能被检测到含有转移灶的肿瘤患者ctDNA含量更高不同肿瘤血液中ctDNA含量存在差异ctDNA在晚期肿瘤患者血液中含量更高Sci Transl Med.2014 Feb 19;6(224):224ra24.ctDNA在临床应用领域的重要价值早期筛查或诊断克隆进化分子分型ctDNA监测病情进展残留病灶评估Nat Rev Cancer.2017 Apr;17(4):223-238.ctDNA在临床应用领域的重要价值2.肿瘤动态监测1.术后判断多次取样定性定量检测肿瘤负荷，追踪药物响应J Clin Oncol.2014 Feb 20;32(6):579-86.与标准CT影像学相比，ctDNA可提前11个月检测到肿瘤复发EMBO Mol Med.2015 Aug;7(8):1034-47.3.用药指导4.异质评估ctDNA能反馈肿瘤进化，新生突变Sci Transl Med.2015 Aug 26;7(302):302ra133.ctDNA能有效反映病人对药物治疗的响应Nat Med.2014 May;20(5):548-54.非小细胞肺癌患者的EGFR基因相关突变 EGFR基因突基因突变变概率：概率：特征人群：特征人群：北美和西欧10%东亚30-50%亚裔、女性、无吸烟史、腺癌 常常见见EGFR基因突基因突变类变类型：型：COSMIC数据数据库库目前目前显显示示EGFR基基19-Dels（45%）L858R（40-45%）因有近千个突因有近千个突变变位点位点T790M（TKI耐药的50%以上）EGFR基因突基因突变变是一是一线线EGFR-TKIs治治疗疗的重要靶点和关的重要靶点和关键键性性预测标预测标志物志物 多个指南均多个指南均强强调调治治疗疗前的基因前的基因检检测测Nat Rev Cancer.2007 Mar;7(3):169-81http:/cancer.sanger.ac.uk/cosmic.NSCLC分子靶点与靶向用药17年3月24日，三代TKI奥希替尼国内上市。中国NSCLC人群：3040%白种NSCLC人群：1020%在靶向治疗前有必要对相关分子靶点进行检测Vari S,et al.Expert Opin Drug Discov,2013.肺癌治肺癌治疗疗策略的策略的变变革革ClinicalOnocologyPathologyOnocologyMolecularOnocologyPrecise TherapyDiseaseGuidedPathologyGuidedMolecularDiagnosticsLess choices：SurgeryIncreasedtherapeuticoptionsThe mutations ofdriver genes astargetsRadiotherapyaccording todifferent tumortypesChemotherapyPresented By Enriqueta Felip at 2015 ELCC;临临床的床的问题问题和需求和需求再活检和动态监测困难没有足够的肿瘤组织肿瘤异质性（时间和空间）侵袭性非侵袭性静态 动态单基因 多基因靶向耐靶向耐药药不可避免不可避免Camidge DR,et al,Nature Rev.,2014,11,473T790M突突变变是主要的耐是主要的耐药药机制机制Yu H A et al.Clin Cancer Res 2013;19:2240-2247T790M突变：一代二代TKI耐药的主要机制2361G 2369CAT(T790M)野生型EGFREGFR伴T790M突EGFR基因空间构象解释T790M耐药机制:T790M突变后，氨基酸侧链变大（苏-蛋），出现空间位阻，阻碍了TKI与EGFR的结合变T790M位点附近存在的SNP影响T790M的检出率Juchum M,et al.Drug Resist Updat.2015 May;20:12-28Sanpeng Xu,et al.Oncol Lett,2016;12:4238-4244T790M组织检测组织检测的空的空间间异异质质性性30位TKI耐药后接受多位点再次活检患者的T790M状态BiopsySite 1T790M BiopsyT790MPatients/Site 2/Patient 1Patient 2Patient 3Patient 4Patient 5Patient 6Patient 7Patient 8Lung tumorLung tumorLung tumorBrain tumorBrain tumorCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSF其中22例匹配的胸部和脑部标本Pleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionLung tumor胸部总计脑部+2-+-02Patient 9Patient 10Patient 11Patient 12Patient 13Patient 14Patient 15Patient 16Patient 17Patient 18Patient 19Patient 20Patient 21Patient 22Patient 23Patient 24Patient 25Patient 26Patient 27Patient 28Patient 29Patient 30101210 2010 22总计Lung tumorLung tumorLung tumor一致性:12/22（55%）Pleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionPleural effusionClavicular LNLung tumorLung(primary)Lung tumorLung tumorCSFCSFCSFCSFAkito Hata,et al.JTO,2015CSFPleural effusionLung(meta)Pleural effusionPleural effusionSkin tumorPleural effusionClavicular LNPericardial effusionAbdominal LNLung tumorLung tumorLung tumorT790M组织检测组织检测的的时间时间异异质质性性24例(12例胸部、6例CSF，6例胸水)使用TKI前后均检测T790M突变状态5位患者停止 TKI治 疗一段时间后，T790M 状 态从阳性变成阴性实时监测的必要性！1位患者在接受高剂量的厄洛替尼后脑脊液的T790M 由 阴性转阳性 :代表接受TKI治疗；：代表停止TKI治疗A：阿法替尼；III：三代TKI；B：贝伐单抗；H-E：高剂量erlotinib；G：易瑞沙Akito Hata,et al.JTO,2015耐耐药药T790M突突变检测变检测挑挑战战？373例初治的患者，298例患者存在T790M突变，比例高达约80%突变丰度1%的患者比例仅为2%；高灵敏度检测方法的必要性！Masaru etal,Clin Cancer Res(2015)二、如何做？1、样本来源多种样本的获取方式和优缺点1.组织活检（肿瘤蜡片）2.细胞学标本（恶性胸水）3.血液标本（ctDNA)样本品质和肿瘤细胞含量可能比组织样本较低当无法获取组织或细胞学样本时，作为有效补充过往的检测金标准DNA 片段/假阴性较多，需要高敏感度方法-+-+-侵入性每个病人都适用+-动态检测对对于于组织组织和胸水都取不到的患者，血液和胸水都取不到的患者，血液样样本是一个很好的本是一个很好的补补充充Pirker R et al.J Thorac Oncol 2010;Savic S et al.Br J Cancer 2008;Rekhtman N et al.J Thorac Oncol 2011;Tanaka T et al.Cancer Sci 2007组织/细胞学检测是目前的金标准，但仍有局限部分患者无组织标本或无足够的组织标本进行基因检测由于肿瘤异质性，重复活检和动态检测困难仅根据初诊时标本指导后续治疗可能产生偏倚1.Pirker R et al.J Thorac Oncol 2010;5:17061713;2.Marchetti A and Normanno N.Patholgica 2010;102:119122;3.Eberhard D et al.J Clin Oncol 2008;26:983994;4.Kimura H et al.Br J Cancer 2006;95:95:13901395;5.Oshita F et al.Br J Cancer 2006;95:10701075;血液检测的优势指指导导用用药药匀匀质标质标本本实时监测实时监测作为无法获取组织标本的补充，无创取样后的检测结果指导临床用药循环而匀质的血液标本，在一定程度有效克服异质性实现实时动态监测，提高全程管理水平1.Molina-Vila M et al.J Thorac Oncol 2008;3:12241235;2.Smouse J et al.Cancer Cytopathol 2009;117:6772;3.Van Ejik R et al.PLoS One 2011;6:e177791;4.Rekhtman N et al.J Thorac Oncol 2011;6:451458EGFR 基因突变检测在临床实践上的问题 研究表明，21.5%的非小细胞肺癌患者初诊时无法获取，或获取到非常有限的活检组织开展后续检测 研究表明，45%的一代TKI耐药患者因为各种原因无法接受二次活检，难以通过二次活检实时监控耐药进展情况。Kaname N,et al.Lung Cancer 2016;101:1-8.Cancer Sci.2016 Jul;107(7):1001-5.ctDNA的临床应用逐渐形成共识非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识2018版-2018肺癌患者EGFR/ALK-TK