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第八章高效液相色谱法及临界流体色谱法———————————————————————————————— 作者：———————————————————————————————— 日期： 第八章 高效液相色谱法及临界流体色谱法根本要求：1. 了解高效液相色谱法的优点及适用范围 2. 理解常用检测器的原理、优缺点及适用范围 3. 理解各种别离方式的原理及适用的分析对象及选择原那么 4. 理解超临界流体色谱法的原理、优缺点及适用范围高效液相色谱法是一种以液体为流动相的现代柱色谱别离分析方法它是在经典液相色谱的根底上，引入气相色谱的理论和技术而开展起来的，因此气相色谱的许多理论与技术同样适用于高效液相色谱高效液相色谱法与气相色谱法的主要差异在于流动相和操作条件在气相色谱中，流动相是惰性的气体，别离主要取决于组分分子与固定相之间的作用力，而在高效液相色谱中，流动相与组分之间有一定亲和力，别离过程的实现是组分、流动相和固定相三者间相互作用的结果，别离不但取决于组分和固定相的性质，还与流动相的性质密切相关高效液相色谱一般可在室温下进展由于采用颗粒极细的固定相，柱内压降很大，加上流动相粘度高，必须采用高入口压，以维持一定的流动相线速。

高效液相色谱法与经典液相色谱法的主要差异在于固定相的性质和粒度等高效液相色谱所用固定相颗粒细而规那么，孔浅，能承受高压，加上使用高压输液设备和高灵敏度的检测器，其别离效率、分析速度和灵敏度都远远高于经典液相色谱法原那么上，只要能溶解在流动相中的物质都可以用高效液相色谱分析，尤其适合那些不宜用气相色谱分析的难挥发性物质、热不稳定性物质、离子型物质和生物大分子等在目前的有机化合物中，有80%的有机化合物能用高效液相色谱法分析由于此法不破坏样品，因此可方便地制备纯样8．1 固定相和流动相 固定相高效液相色谱固定相按承受的高压能力可分为刚性固体和硬胶两大类刚性固体以二氧化硅为基质，它可以承受较高的压力，假设在它的外表键合各种功能团，其应用更广泛硬胶由聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成，承受压力较低，主要用于离子交换和尺寸排阻色谱固定相按孔隙深度可分为外表多孔型和全多孔微粒型两大类，如图8—1所示外表多孔型是在实心玻璃外面覆盖一层多孔活性物质，如硅胶、氧化铝、离子交换剂和聚酰胺等，其厚度为1-2μm，以形成无数向外开放的浅孔全多孔微粒型由直径为10-3μm数量级的硅胶微粒凝聚而成图8-1 高效液相色谱固定相类型(a) 外表多孔型; (b) 全多孔微粒型外表多孔型固定相的多孔层厚度小、孔浅、相对死体积小，出峰快，柱效高。

但因多孔层厚度小，最大允许进样量受限制全多孔微粒型固定相颗粒细，孔仍然浅，因此传质速率仍很快，柱效高，但需更高的操作压力最大允许进样量比外表多孔型大5倍因此，通常采用此类固定相根据别离模式的不同而采用不同性质的固定相，如活性吸附剂、键合有不同极性分子功能团的化学键合相、离子交换剂和具有一定孔径范围的多孔材料，从而分别用作吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱及尺寸排阻色谱固定相,见表6—1 流动相高效液相色谱中，流动相对别离起着极其重要的作用，在固定相选定之后，流动相的选择是最关键的不管采用哪一种色谱别离方式，对用作流动相的溶剂的要求是：(1) 纯度高 溶剂的纯度极大地影响色谱系统的正常操作和色谱别离效果溶剂中假设存在杂质会污染柱子，存在固体颗粒会损害高压泵或输液通道，使压力升高，基线漂移 (2) 粘度低 高效液相色谱中为获得一定流速必须使用高压，假设溶剂粘度较高，操作压力也更大高的压力会使色谱柱性能降低，而且泵也容易损坏 (3) 化学稳定性好 流动相不能与固定相或组分发生任何化学反响 (4) 溶剂沸点要高于55℃ 低沸点溶剂挥发度大，容易使流动相浓度或组成发生变化，也容易产生气泡。

5) 溶剂要能完全浸润固定相 溶剂对所测定的组分要有适宜的极性，最好选择样品的溶剂作流动相，否那么发生溶剂与流动相不相混溶的情况，使别离变坏 (6) 溶剂要与检测器匹配 溶剂要适合于检测器，例如采用示差折光率检测器，必须选择折光率与样品有较大差异的溶剂作流动相；假设采用紫外吸收检测器，所选择的溶剂在检测器的工作波长下不能有紫外吸收8．2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪主要由贮液器、脱气器、高压泵、进样器、色谱柱和检测器等组成如果8-2所示图8-2 高效液相色谱仪示意图 贮液器贮液器用于存放溶剂溶剂必须很纯，贮液器材料要耐腐蚀，对溶剂呈惰性通常采用1-2L的大容量玻璃瓶，也可用不锈钢制成贮液器应配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内溶剂过滤器一般用耐腐蚀的镍合金制成，孔隙大小一般为2μm 脱气装量脱气的目的是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡进入检测器而使噪声剧增，甚至不能正常检测通常用氦气鼓泡来驱除流动相中溶解的气体因为氦气在各种液体中的溶解度极低先用氦气快速清扫溶剂数分钟，然后以极小流量不断流过此溶剂 高压泵高压泵用于输送流动相，其压力一般为几MPa至数十Mpa。

这是因为液体的粘度比气体大102倍，同时固定相的颗粒极细，柱内压降大，为保证一定的流速，必须借助高压迫使流动相通过柱子高压泵应无脉动或脉动极小，以保证输出的流动相具有恒定的流速采用脉动阻尼装置可将产生的脉动除去，使流动相的流量变动范围不宜超过2-3%泵应耐压、耐腐蚀、密封性好泵有恒压泵和恒流泵两类恒压泵输出的压力恒定，如气动放大泵具有一定压力的气体作用在一个大面积活塞上，大面积活塞又驱动一个小面积活塞，小面积活塞承受的压力是大面积活塞的几十倍，从而得到压力恒定的流出液缺点是泵腔体积大，且流量随外界阻力而改变，不适于梯度洗脱它正逐渐被恒流泵所取代恒流泵输出的流量恒定，如往复柱塞泵、螺旋传动注射泵等它与恒压泵不同，通常用电驱动活塞，当活塞迅速向上运动时，由于减压使入口止逆阀开启，出口止逆阀关闭，贮液器中的流动相被吸入泵内当活塞反向运动时，入口止逆阀关闭，出口止逆阀开启，泵内流动相被压入柱内，然后再开场下一个循环使用这种泵时一定要连接脉动阻尼器，将产生的脉动除去假设采用双活塞泵，使双活塞在相移1800下工作，可使脉动互相抵消，减速小噪声往复柱塞泵的流量与外界阻力无关，体积小，非常适于梯度洗脱。

螺旋传动注射泵用电以很慢的恒定速率驱动活塞，使流动相连续输出当活塞到达末端时，输出中止，然后由另一个吸入冲程使溶剂重新充满，再开场第二次输出输出时间的长短决定于泵腔体积及输出流量 梯度洗脱装置比照拟简单的分析问题，可以采用一种均匀的混合溶剂作流动相如果此时别离不良，或分析时间过长，可以采用梯度洗脱的方法，它极类似于气相色谱中程序升温的作用梯度洗脱是在别离过程中通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力的一种方法通过梯度装置将两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进展二元或三元、四元梯度洗脱梯度洗脱一般采用低压梯度，低压梯度采用低压混合设计，只需一个高压泵在常压下，将两种或两种以上溶剂按一定比例混合后，再由高压泵输出，梯度改变可呈线性、指数型或阶梯型图8-3表示用二元梯度来别离几种氨基甲酸酯类杀虫剂采用内径，长度为15cm的C18柱〔5μm颗粒直径〕，溶剂组成在15min内，从10%〔V/V〕CH3CN-H2O随时间改变至50% CH3CN-H2O由于CH3CN量的增多，流动相极性减小，杀虫剂与非极性的固定相C18柱的作用力减弱，而在流动相中的溶解度增大，因而使分析时间缩短图8-3 杀虫剂分析1．灭多虫 2. Aldicarb 3. 虫螨威 4. 西维因 5. Methiocab总之，梯度洗脱具有以下优点：改善峰形；提高柱效；减少分析时间；使强烈滞留的组分不容易残留在柱上，因而可保持柱的性能良好。

但是，在进展下次分析时，更换流动相到达平衡的时间长 进样器高效液相色谱进样普遍使用高压进样阀用微量注射器将样品注入样品环管，样品环管有不同的尺寸〔从10μL到2mL〕，可根据分析要求选用图8-4为六通高压进样阀进样示意图当进样阀手柄放在吸液位置时，流动相直接通过孔2和孔3之间的通路流向色谱柱样品通过注射器从孔4进入样品环管，过量的样品从出口孔6排出然后将手柄转到进样位置，此时流动相便将样品带入柱子图8-4 六通高压进样阀工作示意图 色谱柱色谱柱是整个色谱系统的心脏，它的质量优劣直接影响别离效果色谱柱通常采用优质不锈钢管制成柱内壁要求光洁平滑，否那么内壁的纵向沟痕和外表多孔性也会引起谱带的展宽，柱接头的死体积应尽可能小柱长一般为10-25cm，内径4-5mm假设直径5-10μm固定相颗粒，理论塔板数的可达5104/m尺寸排阻色谱柱的内径通常大于5mm，制备色谱柱那么更大为了减少溶剂用量，可采用微径柱，内径约1mm，长度为30-75mm假设采用3μm颗粒，理论塔板数高达1105/m为了保护分析柱不被污染，有时需在分析柱前加一短柱，约数厘米长此柱称为卫柱为了防止由于卫柱而过分增加柱阻力，在卫柱中使用的颗粒大小约10-30μm。

检测器高效液相色谱常用的检测器有吸收、示差折光率、荧光和安培检测器等对它们的要求和性能指标与气相色谱检测器根本一样1． 吸收检测器主要包括紫外吸收检测器〔ultra-violet detector,UVD〕和二极管阵列检测器〔diod-array detector,DAD〕紫外吸收检测器是一种选择性浓度型检测器，它仅对那些在紫外波长下有吸收的物质有响应它具有灵敏度高、噪声低等优点，在高效液相色谱中应用最广，约占70%其构造如图8-5所示图8-5 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器常用氘灯作光源，氘灯那么发射出紫外—可见区范围的连续辐射,并安装一个光栅型单色器，通过扫描获得所需的工作波长它有两个流通池，一个作参比，一个作测量用光源发出的紫外光照射到流通池上，假设两流通池通过纯的均匀溶剂，它们在紫外波长下几乎无吸收，光电管上承受到的辐射强度相等，无信号输出当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管承受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号的大小与组分浓度有关紫外流通池有Z型和H型，见图8-6H型具有抵消流动相对光线的干扰，减少噪声和漂移的特点为了减少峰的展宽，池体积约在1-10μL。

图8-6 Z型和H型流通池紫外吸收检测器的灵敏度很高，许多功能团在紫外区有很高的摩尔吸光系数假设采用可调波长的氘灯作光源，在组分的最大吸收波长处进展检测，其检测灵敏度可达〔满刻度吸收单位〕，最小检测量为几个ng紫外吸收检测器适用于梯度洗脱，对流动相速度变化不敏感，流动相组成的变化对检测器响应几乎无影响但是只有在检测器所提供的波长下有较大吸收的分子才能进展检测，而且流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能作流动相每种溶剂都有紫外截止波长当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下因此检测器的工作波长不能小于溶剂的。