2022年BDFACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤_corr_ZYH_20210520.pdf

电子版本 : 流式细胞仪 BD FACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤_corr_ZYH_20140520- 1 - BD FACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤一、开机1） 先打开净化交流稳压电源，其次打开110V 稳压输出电源，再次打开流式细胞仪，最后打开计算机2） 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，先将减压阀（红色箭头所示）方向调在VENT 位置（箭头方向），再加入超纯水，保持水位在鞘液桶的3/4 左右，加好后拧紧桶盖并将减压阀方向调在RUN 位置二、开启CellQuest 软件、编辑实验文件1） 在屏幕下方点击CELLQuest （第四个图标）启动软件桌面会出现一Untitled 实验文件，可点击实验文件的左上角的放大钮（绿色），将实验文件窗口放大名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 1 页，共 10 页 - - - - - - - - - 2） 从工具板中点击散点图图示在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。

出现散点图对话方框（当所要编辑的图窗口被选中时，会在其四角出现四个小黑块）3） 在出现的散点图对话方框中点击Plot Source ，选择 Acquisition and Analysis (收取、分析 ) ，确认 X 和 Y 轴参数预设为FSC-H 1024 、SSC-H 1024 4）从屏幕上方Plots 菜单中选择Dot Plot 功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X 轴： FL1-H 1024 ；如果是双标，Y 轴选择： FL2-H 1024( 根据实验检测样品确定所选通道，本步骤选FL1/FL2 来说明 )，如果是单标，Y 轴选择： SSC-H 点击 OK ，FL1/FL2 的散点图出现完成后可将重制图移至原图右方名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 2 页，共 10 页 - - - - - - - - - 说明： 散点图（ Dotplot ），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系在图中，横坐标 X 轴和纵坐标Y 轴参数分别设为FSC-H 1024 、SSC-H 1024 ；双荧光标记时，第二图X 和 Y 轴参数分别设为FL1-H 1024 、FL2-H 1024 ，X 轴为为荧光 1 强度的相对值，单位是道数， Y 轴则通常表示荧光2 或光散射强度的相对值。

仪器使用者可因实验需求来修改所有图谱中显示之参数修改动作为轻击图谱上X 和 Y 轴参数，并依需要选择之（FSC ：细胞大小， SSC ：细胞折射率，FL1 ：FITC 绿色荧光，FL2 ：PE 橙色荧光， FL3 ：PerCP 红色荧光）5） 在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2 散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在（x，y）（ 101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域6）从工具板中点击直方图图示，在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标单色荧光只需一个直方图，和第二个散点图一样，横坐标选择FL-1 ，纵坐标默认为Counts ；若是双色荧光，需画2 个直方图，一个横坐标选择FL-1-1024 ，另一个横坐标选择FL-2-1024 ；7）在上面直方图中画出M1 和 M2，其中 M1 代表隐性数目（一般标示是101）， M2 代表阳性数目（除M1 以外所有的部分）8）从 Stats 菜单中选择Quadrant Stats（象限统计） ,5）步骤中的点图将分为四个象限名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 3 页，共 10 页 - - - - - - - - - 三、建立仪器和计算机之间通讯从 Acquire 菜单中选择Connect to Cytometer (快捷键 Win+b) ，此时会出现Acquisition Control 对话方框。

四、仪器设置文件注意： 实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件仪器设定文件（Instrument settings ），含信号器高压（Detector/ Amps），阈值（ Threshold ），荧光补偿（Compensation ）等仪器条件的组合一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps - Threshold - Compensation1） 检查现有仪器条件，从Cytometer 菜单中选择Detectors/Amps出现 Detectors/Amps窗口在Detectors/Amps窗口确认FSC 与 SSC （根据实验样品确定，一般细胞选择LIN，细菌选择LOG ），其它FL1-3 为LOG （对数放大），将其拖至空白区2）从 Cytometer菜单中选择Threshold ，出现 Threshold 窗口在 Threshold 窗口：确认FSC 为设阈参数，初步确认预设阈值52将其拖至空白区3）从 Cytometer 菜单中选择Compensation，确认所有预设数值皆为零将其拖至空白区。

名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 4 页，共 10 页 - - - - - - - - - 五、 上样品、设置仪器使仪器处于High RUN ，样品管支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位确认Acquisition Control 窗口中 Setup 前需打叉或打勾 (即不储存数据，用于仪器设置)，点击 Acquire 1、调节 FSC/SSC 探测器（电压）观察 FSC/SSC 图的变化 FSC 电压 (Voltage) 预设为 E00 ，可调节 Amp Gain 从 1.009.99 使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC 电压设置于E-1；较小细胞，将FSC 电压设置于E01 ）调节SSC 电压使主要细胞群得以清楚呈现调节FSC/SSC 图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象调整定位后，点击Acquisition Control 窗口中的Pause 2、Gating 圈选细胞检品中，常含有大小不同、性质相异的细胞群体。

我们常用前方散射（FSC ）与侧方散射（ SSC ）的二维位图，即散射光图谱（Scatter Plot ），来圈选出不同细胞群的范围，选择性显示出有意义的细胞群体，如下图圈选白血球之淋巴细胞族群1） 在工具板中选择多边形的Region ，在 FSC/SSC 散点图上划定淋巴细胞R1 区域（如下图）分析样品时，区域内细胞应会呈现成红色，可移动或改变形状来圈选有意义的细胞如果要删除R1 区域，您可以在工具列中点选Gates Region list，以鼠标点选 R1，再按 Delete键删除 R1 区域删除R1 区域后，可用绘图工具板，重画R1名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 5 页，共 10 页 - - - - - - - - - 2） 选取希望 Gate 的 FL1/FL2 散点图，从Plots 菜单中选择Format dot plot在出现的对话方框内，将No Gate 改选 G1=R1 点击 OK 3、调节 FL1 、FL2 的探测器（电压）1）点击 Acquisition Control 窗口中的Restart 。

在 Detector/Amps 窗口中调节FL1 、FL2的电压，使Negative Control细胞群着落在所选直方图或散点图之100-101处名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 6 页，共 10 页 - - - - - - - - - 2）在 Threshold 窗口，适当地提高FSC 阈值 52，以去除碎片或低阶噪音唯需注意不要切掉主要细胞族群3）点击 Acquisition Control 窗口中的Pause 、Abort 移去阴性对照管，我们已设定好有意义细胞群之自体荧光，不要再改动Detector/Amps、Threshold等数值4、调节荧光补偿说明：最适化的最后一步是调节光谱重迭如是单色荧光实验可跳过此步骤）如是 2 色样本，必要时需调节FL2-%FL1 ，FL1-%FL2 （若 3 色样本，必要时需调节FL2-%FL1 、FL1-%FL2 、FL3-%FL2 、FL2-%FL3的补偿）1） High RUN ，换上单染CD3-FITC 管。

点击Acquisition Control 窗口中的Acquire 调节 FL2-%FL1 使 FITC 阳性细胞在 FL1/FL2 散点图的右下象限补偿调节可通过点击来选择或直接拖动滑标上下移动调节完毕，点击Acquisition Control 窗口中的Pause 2） 移去单染 CD3 ，换上单染CD19-PE 管点击Acquisition Control 窗口中的 Restart 调节 FL1-%FL2 使 PE+ 细胞在FL1/FL2散点图的左上象限调节完毕，点击Acquisition Control 窗口中的Pause 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 7 页，共 10 页 - - - - - - - - - 3.）最后以CD3-FITC/CD19-PE双染样本上机，点击Acquisition Control窗口中的 Restart ，确定三群细胞工整垂直当您已完成2 色荧光之光谱重迭时，点击 Acquisition Control窗口中的 Pause 、Abort 。

4）移去样本管，换上dH2O 管，让仪器暂且处于Standby 状态关闭Compensation窗口您已完成2 色荧光之最适化六、收集实验数据1）决定储存细胞总数：预设之储存细胞总数为10000 如需修改，从Acquire 菜单中选择 Acquisition & Storage，并在出现的窗口功，确认Collection Criteria从10000 of All ，再点击OK 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -精心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 8 页，共 10 页 - - - - - - - - - 2） 找个档案匣准备储存数据，本机所有数据都贮存在D 盘 data 盘中，按实验日期编排从 Acquire 菜单中选择Parameter Description，出现 Parameter Description对话方框点击Folder ，并在随后出现之对话方框，选择Your Folder 或新建活页夹，点击此对话方框的Select Your Folder （一般用实验日期来命名Folder ）。

3） 命名即将储存之文件名：点击Pa。