分子生物学中心法则.ppt

优选）分子生物学中心法则1页，共45页，星期二Reverse transcription中心法则及补充中心法则及补充2页，共45页，星期二第第1919章章 DNADNA复制与修复复制与修复n（一）复制方式：半保留复制 物质基础：双螺旋结构3页，共45页，星期二氮标记技术证实了DNA的半保留复制 n以15NH4Cl为唯一氮源培养大肠杆菌，连续培养12代，使所有DNA标记上15N；n在普通培养基（14N)培养一代后，所有DNA密度介于14N 15N之间；n培养两代后， 14N和14N 15N杂合分子等量出现n继续培养， 14N分子增多4页，共45页，星期二深蓝深蓝: 15N)(粉红粉红: 14N)DNADNA半保留复制的证据半保留复制的证据培养于普培养于普通培养液通培养液继续培养于继续培养于 普通培养液普通培养液含含15N-DNA的细菌的细菌普通普通DNA重重DNA第一代第一代中等密度中等密度DNA第二代第二代普通普通DNA中等密度中等密度DNA 5页，共45页，星期二6页，共45页，星期二7页，共45页，星期二第二节 原核生物DNA的复制nDNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下，将游离的四种脱氧三核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,简写为dNTP)聚合成DNA的过程。

n这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多种酶和蛋白质参与8页，共45页，星期二一、DNA复制所需原料n1） 底物：dATP，dGTP，dCTP，dTTP，总称为dNTPn2） DNA聚合酶，DNA-poln3） 模板模板（template）：解开成单链的 DNA母链n4） 引物引物（primer）：RNA引物n5） 其他酶和蛋白质因子其他酶和蛋白质因子9页，共45页，星期二1 1、DNADNA聚合酶复制的基本酶聚合酶复制的基本酶n作用特点：从引物游离3OH开始加入脱氧核苷酸，需要底物，引物，模板，模板，能量，Mg2+nDNA聚合酶为DNA指导的酶10页，共45页，星期二原核细胞DNA聚合酶539DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 53聚合活性 + +聚合速度nt/s1620 7 2501000 对dNTP亲和力 低低高53外切活性 +-+35 外切活性 +功能 修复修复; ;去除去除引物；填补引物；填补空缺空缺 协助修协助修复复主要复制主要复制酶酶DNA聚合酶聚合酶和和：与突变存活有关的酶与突变存活有关的酶11页，共45页，星期二DNA-pol 的的 53聚合作用聚合作用355335DNA-pol53OHP12页，共45页，星期二。

DNA-pol I 5 3外切活性外切活性切除引物，切除突变片段切除引物，切除突变片段DNA-pol I 35外切活性：外切活性：校读（校读（proofread）功能功能53AG5313页，共45页，星期二小片段小片段 大片段大片段 （Klenow fragment）5 3 聚合功能，聚合功能， 3 5 外切酶活性外切酶活性5 3 外切酶活性外切酶活性DNA pol I的酶切片段的酶切片段EJPNMLHIORQGCDBFAK14页，共45页，星期二引物酶引物酶( (PrimasePrimase) ) 55DNA合成需在合成需在RNA引物引物的基础上进行的基础上进行RNA引物引物535315页，共45页，星期二解除DNA高级结构的酶与蛋白：nDNA复制从起始点开始复制时，局部的DNA双链必须打开，主要靠解螺旋酶（helicase)的作用，打开后的单链还需要单链结合蛋白与其结合，防止复性n在复制叉向前移动时造成前方DNA分子产生正超螺旋，必须由拓扑异构酶来解决16页，共45页，星期二3 3、解螺旋酶、解螺旋酶 (helicase) (helicase)解螺旋酶解螺旋酶作用作用：断裂互补碱基间的氢键，使：断裂互补碱基间的氢键，使DNADNA成单链。

成单链基因：基因：dnaA、B、C蛋白：蛋白：DnaA、B、CATP17页，共45页，星期二4 4、拓扑异构酶、拓扑异构酶（topoisomerase,Topotopoisomerase,Topo）一类能调节DNA分子超螺旋类型和水平的酶DNA正超螺旋与负超螺旋正超螺旋与负超螺旋复制后形成复制后形成负超螺旋负超螺旋复制前方形成复制前方形成正超螺旋正超螺旋DNA双螺旋双螺旋拓扑异拓扑异构酶构酶酶，引入负超螺旋18页，共45页，星期二 消除复制叉前方形成的正超螺旋，即引消除复制叉前方形成的正超螺旋，即引入入负超螺旋负超螺旋切割DNA双链，双链，此时此时不需不需ATP；尔后由尔后由ATP供能，连接切口供能，连接切口不需不需ATP，切割双链，切割双链DNA中的中的一链一链，使使DNA松弛后松弛后, 连接切口连接切口Topo:Topo: 临床上使用的某些抗肿瘤药（如喜树碱等）是临床上使用的某些抗肿瘤药（如喜树碱等）是通过通过抑制抑制Topo酶活性酶活性而杀死肿瘤细胞的而杀死肿瘤细胞的作用方式：作用方式：切割切割DNA链，使其松弛后再连接链，使其松弛后再连接19页，共45页，星期二5、DNA连接酶连接连接酶连接DNA片断的酶片断的酶n连接酶(ligase)的作用是催化相邻的DNA片段以3、5磷酸二酯键相连接。

连接反应中的能量来自ATP(动物细胞或噬菌体）或NAD（细菌)n 连接酶要求催化反应时缺口处有一条链是连续的不能将两条游离的DNA分子连接起来20页，共45页，星期二连接酶的催化反应连接酶的催化反应21页，共45页，星期二二、DNA复制过程(544)n各种生物DNA的复制过程大同小异，大致包括以下几个阶段1、起始有固定的起点、起始有固定的起点n（1）识别起始位点 复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点(original replication)常用ori或o表示多双向、对称等速复制22页，共45页，星期二大肠杆菌的大肠杆菌的ori Cn大肠杆菌染色体DNA复制起始点ori C由245bp组成，关键序列在于两组短的重复：三个13bp和四个9bp组成的保守序列，是大肠杆菌中DnaA蛋白识别的位置23页，共45页，星期二2）DNA解旋，形成复制叉n解旋酶、拓扑异构酶与复制起点结合，解开双螺旋成两条局部的单链，SSB也随即结合上保护单链n（3）RNA引物的合成 引物合成酶结合上去，形成结构复杂的引发体引物合成酶合成引物合成引物 24页，共45页，星期二起始：起始：Ori C开始，开始，形成复杂形成复杂的引发体，的引发体，合成合成RNA引物引物25页，共45页，星期二。

2、延伸酶催化以高速度进行n在DNA聚合酶聚合酶的催化下，根据模板链35的核苷酸顺序，从引物游离3OH开始加入脱氧核苷酸，直至合成整个DNA片断n酶的催化方向：53，所以新生DNA链的延伸方向也是53n两条链复制又同时进行如何解决？一条链连续合成，称为前导链；另一条链不连续合成，为滞后链冈崎片断：以DNA 5 3链为模板时合成的不连续的较短的DNA片断26页，共45页，星期二The model of DNA-pol III form the catalytic core Links two coresLeading strand synthesisLagging strand synthesis act as a clamp27页，共45页，星期二复制过程：两条链同时进行28页，共45页，星期二聚合酶切除引物连接酶连接冈崎片断聚合酶合成冈崎片断29页，共45页，星期二3、终止n两复制叉在终止区相遇，形成的连锁体由拓扑异构酶分开终止子ter和终止蛋白Tus防止复制叉超过终止区过界复制30页，共45页，星期二31页，共45页，星期二第三节 真核生物DNA的复制真核DNA的合成的基本过程类似于原核DNA，不同之处：l 多复制起点l 至少有五种聚合酶l 端粒的复制依赖于端粒酶 32页，共45页，星期二。

1）真核细胞多复制起点33页，共45页，星期二2）真核生物DNA聚合酶n真核生物至少拥有5种DNA聚合酶，分别命名为、及能在53方向聚合DNA链，但功能不尽相同n 真核细胞中与DNA复制有关的酶是DNApol（合成引物）和(合成前导链和滞后链）还具有35外切酶的校正功能，并具有解螺旋的作用n酶和：参与修复n酶参与线粒体DNA复制34页，共45页，星期二3 3）端粒及端粒酶）端粒及端粒酶n真核生物染色体真核生物染色体DNADNA是线性的，每复制一是线性的，每复制一次，子链的次，子链的55有缺失n33端有特殊的序列端有特殊的序列, ,是线性是线性DNADNA末端复制末端复制必需的必需的 -端粒端粒n作用：稳定染色体作用：稳定染色体35页，共45页，星期二线形线形DNADNA复制末端问题复制末端问题5353535336页，共45页，星期二端粒缩短37页，共45页，星期二38页，共45页，星期二第四节第四节 反转录反转录n逆转录：在RNA指导下DNA的合成即以RNA为模板，合成DNA的过程n此过程和一般遗传信息流转录的方向相反，故称为反转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶(reverse transcriptase) 。

n反转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中，哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶 39页，共45页，星期二反转录酶的活性反转录酶的活性 n RNA指导的DNA聚合酶活性：反转录酶中不具有35外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高nRNase H活性：由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，由RNase H从RNA5端水解掉RNA分子nDNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子40页，共45页，星期二RNA模板模板逆转录活性逆转录活性RNaseHRNaseH活性活性RNA:DNA杂化双链杂化双链单链单链DNADNA pol活性活性整合整合(integration)入细胞基因组入细胞基因组双链双链DNA 病毒基因组通过病毒基因组通过基因重基因重组组插入到宿主细胞基因组中，插入到宿主细胞基因组中，称为称为整合整合tRNA引物引物41页，共45页，星期二逆转录酶将RNA逆转录成双链DNA，与宿主细胞DNA整合，可能导致癌变！病毒DNA随宿主细胞复制，转录生成RNA并翻译成蛋白。

RNA和蛋白组装成病毒42页，共45页，星期二第五节DNA的损伤修复一、一、DNADNA的损伤（突变）的概念的损伤（突变）的概念nDNA分子一级结构的改变分子一级结构的改变称为称为DNA损伤损伤(DNA damage)或突变（或突变（mutation）n自发突变：自发突变：大多数突变属此类，原因不明大多数突变属此类，原因不明n诱发突变：诱发突变：由理化因素诱发由理化因素诱发 物理因素（紫外、高能射线、电离辐射）n 化学因素（5-F-U，烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类 似物）43页，共45页，星期二二、突变的类型二、突变的类型1. 点突变点突变（point mutation） 也称错配也称错配（mismatch）DNA链上碱基的置换链上碱基的置换CTCGluCACValHbA 肽链肽链HbA 基因基因HbS 基因基因HbS 肽链肽链ATGC44页，共45页，星期二2. 缺失、插入和相应的缺失、插入和相应的框移突变框移突变5. UCACGACAUAUG.35.UCAGCGACAUAUG.3丝丝精精组组蛋蛋丝丝丙丙苏苏酪酪5. UCAGACAUAUG.3丝丝天天异亮异亮插入插入缺失缺失正常正常框移突变框移突变是最严重的突变是最严重的突变！45页，共45页，星期二。