吉林省吉林市长岭县第四中学高二生物 3.4多聚酶链式反应课件.ppt

多聚酶链式反应多聚酶链式反应扩增扩增DNADNA片断片断一、基础知识一、基础知识（一）（一）DNADNA分子的结构分子的结构C C、、HH、、OO、、N N、、P P1 1、组成元素、组成元素脱氧核苷酸脱氧核苷酸2 2、基本单位、基本单位3 3、脱氧核苷酸结构、脱氧核苷酸结构脱氧核脱氧核苷酸苷酸脱氧核苷脱氧核苷磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮含氮碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤（腺嘌呤（A A））鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G））胞嘧啶（胞嘧啶（C C））胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T））一个核苷酸上的一个核苷酸上的磷酸基团上的磷酸基团上的“－－OHOH”和和另一另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失之间失去一分子水，形成去一分子水，形成磷酸二脂键，磷酸二脂键，即在即在相邻的相邻的两两个脱氧核苷酸的个脱氧核苷酸的3 3’和和5 5’碳原子碳原子之间形成磷酸之间形成磷酸二脂键数量庞大的四种脱氧核苷酸通过二脂键数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3 3’、、5 5’、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链通常将通常将DNADNA的的羟基羟基“－－OHOH”末端称为末端称为3 3’端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为5 5’端端4 4、多脱氧核苷酸链得形成、多脱氧核苷酸链得形成脱氧核苷酸结构式脱氧核苷酸结构式OOPOHO碱基碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基5’3’3’5’碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖磷酸基团磷酸基团磷酸基团磷酸基团碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖5’3’多脱氧核苷酸链结构简图多脱氧核苷酸链结构简图（二）（二） PCR(PCR(多聚酶链式反应）多聚酶链式反应）1 1、、 DNADNA聚合酶聚合酶特性特性不能从头合成不能从头合成DNADNA，只能从，只能从DNADNA的的3′3′端开始端开始延伸延伸DNADNA链，因此，链，因此， DNADNA复制需要引物复制需要引物2 2、、 DNADNA聚合酶聚合酶作用过程作用过程当引物与当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后， DNADNA聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的3′3′端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链， DNADNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5′5′端向端向3′3′端延伸端延伸3 3、、 PCRPCR原理原理①①在在8080－－100100°°C C的温度范围内，的温度范围内， DNADNA的双螺的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性②②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNADNA链链又会重新结合成双链又会重新结合成双链③ PCR③ PCR利用了利用了DNADNA的热变性原理，通过控制温的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCRPCR仪仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器实质上也是一台能够自动调控温度的仪器高温解决了打开双链的问题，但是，又导致高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNADNA聚合酶失活的问题，耐高温的聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNATaq DNA聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致DNADNA聚合酶失活的问聚合酶失活的问题，促成了题，促成了PCRPCR技术的自动化技术的自动化4 4、、 Taq DNATaq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用5 5、、 缓冲液需要为缓冲液需要为PCRPCR反应提供的物质反应提供的物质DNADNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNADNA聚合酶，同聚合酶，同时通过控制温度使时通过控制温度使DNADNA复制在体外反复进行复制在体外反复进行PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。

扩增技术 它具有特异、敏感、产率高、它具有特异、敏感、产率高、 快快速、速、 简便、重复性好、易自动化等突出简便、重复性好、易自动化等突出 6 6、、 PCRPCR技术的特点技术的特点7 7、、细胞内和细胞外细胞内和细胞外DNADNA复制环境的区别复制环境的区别体内体内DNADNA的复制的复制体外的模拟体外的模拟模板（母链）模板（母链） 细胞内源细胞内源外源加入外源加入引物引物引物合成酶引物合成酶外源加入外源加入底物底物dNTPdNTP细胞内源细胞内源外源加入外源加入聚合酶聚合酶细胞内源细胞内源外源加入外源加入反应环境反应环境细胞内环境细胞内环境缓冲液缓冲液① PCR① PCR过程需要的引物不是过程需要的引物不是RNARNA，而是人工，而是人工合成的合成的DNADNA单链，其长度通常为单链，其长度通常为2020－－3030个脱个脱氧核苷酸氧核苷酸8 8、细胞内复制和、细胞内复制和PCRPCR不同点不同点② PCR② PCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的通过对反应温度的控制来实现的（三）（三） PCRPCR的反应过程的反应过程1 1、、PCRPCR的反应步骤的反应步骤PCRPCR一般经历三十多次循环，一般经历三十多次循环，每次循环可以每次循环可以分为三个基本步骤分为三个基本步骤────变性、复性和延伸变性、复性和延伸①①变性（模板变性（模板DNADNA解旋）解旋）模板模板DNADNA经加热至经加热至90900 0C C以上。

一定时间后，使以上一定时间后，使模板模板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备轮反应作准备2 2、循环过程、循环过程靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列PCR PCR 循环第一步循环第一步 ：加热变性：加热变性②②复性（退火）复性（退火）模板模板DNADNA经加热变性成单链后，温度降到经加热变性成单链后，温度降到55550 0C C左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合单链的互补序列配对结合靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物 ⅠⅠⅠⅠ引物引物引物引物 ⅡⅡⅡⅡ5 5 5 5’ ’3 3 3 3’ ’5 5 5 5’ ’5 5 5 5’ ’3 3 3 3’ ’5 5 5 5’ ’3 3 3 3’ ’3 3 3 3’ ’PCR PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火③③延伸延伸DNADNA模板－引物结合物在模板－引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的成一条新的DNADNA链链靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物ⅠⅠ引物引物引物引物ⅡⅡ5 5 5 5’ ’3 3 3 3’ ’5 5 5 5’ ’5 5 5 5’ ’3 3 3 3’ ’5 5 5 5’ ’3 3 3 3’ ’3 3 3 3’ ’Taq DNATaq DNATaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸靶序列靶序列靶序列靶序列 靶序列靶序列靶序列靶序列第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 ：得到两个拷贝的：得到两个拷贝的靶序列靶序列循环循环次数次数DNADNA数量数量1 12 22 24 43 38 820201,048,5761,048,57630301,073,741,8241,073,741,8243 3、、3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量4 4、、PCR PCR 循环的结果循环的结果② DNA② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的物之间的DNADNA序列，使这段固定长度的序列呈序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增指数扩增①①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物为模板参与反应，并且由引物ⅠⅠ延伸而成的延伸而成的DNADNA单链会与引物单链会与引物ⅡⅡ结合，进行结合，进行DNADNA的延伸的延伸二、二、 PCR PCR 的实验操作的实验操作1 1、、PCRPCR仪仪（一）设备及用具（一）设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器的仪器2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液体，液体，其上其上的一次性吸液枪头用一次更换一次的一次性吸液枪头用一次更换一次PCRPCR仪仪微量离心管微量离心管微量移液器微量移液器1 1、准备、准备2 2、移液、移液（二）实验操作步骤（二）实验操作步骤按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的试剂摆反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上放在实验桌上用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方往微反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂量离心管里面加入各种试剂①①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁轻轻弹击管壁②②注意：注意：3 3、混合、混合B B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀是使反应液混合均匀A A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢脱落或液体外溢将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，设置好PCRPCR仪的循仪的循环程序环程序①①过程：将微量离心管放在离心机上过程：将微量离心管放在离心机上, ,离心约离心约10s10s4 4、离心、离心5 5、反应、反应②②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果提高反应效果循环数循环数变性变性复性复性延伸延伸第一次第一次9494°°C C，，10min10min－－－－3030次次９９4℃4℃，，30s30s55℃55℃，，30s30s 72℃72℃，，1min1min最后一次最后一次９９4℃4℃，，1min1min55℃55℃，，30s30s 72℃72℃，，1min1minPCRPCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免外源为了避免外源DNADNA等因素的等因素的污染而造成干扰实验，污染而造成干扰实验，PCRPCR操作时要注意做到：操作时要注意做到：6 6、注意事项、注意事项①①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；②②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头（一）理论上（一）理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算三、三、课题成果评价课题成果评价1 1 、、一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次， DNADNA为为2 2 n n2 2 、、 a a条条DNADNA，复制，复制n n次，次， DNADNA为为a x2 a x2 n n（二）实验中（二）实验中DNADNA含量的测定含量的测定1 1 、、原理原理可以通过计算可以通过计算DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸收的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与峰，峰值的大小与DNADNA的含量有关的含量有关2 2 、、过程过程①①稀释稀释2uLPCR2uLPCR反应液，加入反应液，加入98uL98uL蒸馏水，即将蒸馏水，即将样品进行样品进行5050倍稀释倍稀释②②对照调零对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm260nm处，处，将紫外分光光度计的读数调节至零将紫外分光光度计的读数调节至零取取DNADNA稀释液稀释液100uL100uL至比色杯中，测定至比色杯中，测定260nm260nm处的光吸收值处的光吸收值③③计算计算④④计算计算DNADNA含量（含量（ g g）＝）＝50 x (260nm50 x (260nm的读数的读数x x稀释稀释倍数倍数5050：：1 1  g g /ml /ml的的DNADNA在厚度为在厚度为1cm1cm比色杯中比色杯中的吸光值为的吸光值为0.020.02比色杯比色杯四、四、 课题延伸课题延伸例如：例如：PCRPCR产物每轮循环增加一倍，产物每轮循环增加一倍，3030轮循轮循环扩增量达环扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109 9拷贝）拷贝）PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。

扩增技术 它具有特异、敏感、产率高、它具有特异、敏感、产率高、 快快速、速、 简便、重复性好、易自动化等突出特点简便、重复性好、易自动化等突出特点五、实验小结五、实验小结 PCRPCR仪仪加加热热使使（（ ））变变性性, , 复复性性使使引引物物与与模模板板DNADNA（（ ））, ,延延伸伸需需将将反反应应温温度度升升至至中中温温( ( ), ),在在（（ ））的的作作用用下下, ,以以 （（ ））为为原原料料, ,以以（（ ））为为复复制制的的起起点点, ,合合成成新新链链 如如此此重重复复改改变变反反应应温温度度, ,经经（（ ））三三个个阶阶段段为为一一个个循循环环, ,每每一一次次循循环环使使特特异异区区段段的的基基因因拷拷贝贝数数放放大大一一倍倍, ,一一般般样样品品是是经经过过3030次次循循环环, ,最最终终使使基基因因放放大大了了数数百百万万倍倍; ; 将将扩扩增增产产物物进进行行电电泳泳, ,经经溴溴化化乙乙锭锭染染色色, ,在在紫紫外外灯灯照照射射下下肉肉眼眼能能见见到到扩扩增增特特异区段的异区段的DNADNA带。

带模板模板互补互补TaqTaq聚合酶聚合酶四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸引物引物变性、复性和延伸变性、复性和延伸72℃72℃。