2022年核酸定量与光吸收值.pdf

页眉内容页脚内容260/280；260/230 &核酸定量核酸在波长260 nm处有最高吸收峰吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、 核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性但紫外法不能区分DNA 和 RNA ，只能用来鉴定核酸的纯度和含量蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大RNA 的260nm与 280nm吸收的比值在2.0 以上； DNA的 260nm与 280nm吸收的比值则在1.9 左右当样品中蛋白质含量较高时比值即下降核酸的定量DNA 和 RNA 都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处，每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数如：1OD 的吸光值分别相当于50 g / ml 的 dsDNA，37 g / ml 的 ssDNA ， 40 g/ml的 RNA ，30 g/ml的寡核苷酸 测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度，这些由分光光度计内预设的程序执行，因此，测试前选择正确的程序，测试样品的类型，首先测试空白液，然后再测试样品，注意输入样品稀释倍数。

如何避免吸光值漂移读数不稳定可能是实验者最头痛的问题灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度核酸本身物化性质溶解核酸的缓冲液的pH 值、离子浓度等在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数 核酸的吸光值受pH 值和缓冲液离子浓度影响只有在一定的pH 值和低离子浓度的条件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0） ，才能得到精确的检测结果水的pH 值不稳定，可能导致检测误差一些缓冲液在精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 1 页，共 4 页 - - - - - - - - - - 页眉内容页脚内容紫外范围内存在自身吸收，为了确保准确测量，请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素，由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品这些小颗粒的存在干扰测试效果 为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ， 吸光值最好在0.1-1.5 A。

在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）操作因素如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项各波长具体含义及相关问题1.A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1 至 1.0 如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05 ，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响DNA样品的 A260 吸光度值是否 0.1 （请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于0.1 ，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值2 也就是说，如果 RNA 样品的260/280=2，260/2301，那么污染原因就应该考虑是胍盐残留其他：精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 3 页，共 4 页 - - - - - - - - - - 页眉内容页脚内容用分光光度计测量RNA 时，用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA 样品会造成A260/A280比值下降。

原因是低离子强度和低pH 溶液会增加280 nm处的光吸收值氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多，那样就很容易被蛋白污染，所以现在一般取400ul 左右当260/2301时，只有两种情况一是胍盐污染，二是蛋白污染精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 4 页，共 4 页 - - - - - - - - - - 。