BIOSEP12蛋白质沉淀法讲课教案.ppt

第十二章蛋白质沉淀法1、概述2、蛋白质溶解3、蛋白质溶液的稳定因素4、蛋白质沉淀方法分类5、盐析法6、|pH水 pI| Value调节法7、有机溶剂沉淀法8、亲水聚合物沉淀法9、沉淀动力学10、Applications 1 概述 定义常用加入试剂的方法，改变溶剂和溶质的能量平衡来降低其溶解度，使产物离开溶液生成不溶性颗粒，沉降析出沉淀具有浓缩与分离的双重作用与结晶联系 在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化，当然也存在化学反应的沉淀或结晶区别结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出，沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出1 概述 优点A、设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越有利，收率越高； B、原料液体积很快地减小1050倍，从而简化生产工艺、降低生产费用；C、使中间产物保持在一个中性温和的环境；D、及早地将目标pro.从其pro.水解酶分离出来，避免pro降解，提高产物稳定性；E、用沉淀法作为pro色谱分离前处理，可使使用色谱分离的限制因素降低到最少缺点：A、沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂，所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低；B、过滤较困难3 蛋白质溶液的稳定因素1)、水化层(hydration shell)tight hydration shell(0.35g water/1g pro)loose hydration shell(2g water /1g pro)2)、静电排斥 zeta电势Nernst Potential胶核表面电位(不可测)Stern Potential(不可测) Potential滑面电位(可测,mobility) 电位 Nernst电位 ionic strength3)、|pH水 pI| Value |pH水 pI| Value zeta电势 水化层 静电排斥Tight hydration shellProtein coreLoose hydration shell4 蛋白质沉淀方法分类1）、盐析法2）、有机溶剂沉淀法3）、 |pH水 pI| Value调节法4）、亲水聚合物沉淀法5）、聚电解质絮凝法6）、高价金属离子沉淀法7）、亲和沉淀法5 盐析法机理：A、zeta potential；B、hydration shell5 盐析法计算: Cohnx经验公式 式中, S为蛋白质的溶解度(g/L)；I为离子强度；m为盐的摩尔浓度；值为蛋白质在纯水中(I=0时)的假想溶解度对数值，是pH值和温度的函数，在蛋白质pI时最小；Ks为盐析常数，与温度和pH值无关。

5 盐析法方法: A、 “Ks”分级盐析法：在一定pH值及温度下，改变盐浓度（即I）达到沉淀的目的B、“”分级盐析法：在一定I下，改变溶液的pH值及温度达到沉淀的目的C、应用：一般的初步分离用第一种方法，进一步纯化时用第二种方法5 盐析法影响因素A、无机盐种类感胶离子序(Hofmeister序列): In 1888，Hofmeister对一系列盐沉淀蛋白质的能力进行了测定研究阴离子排序为：柠檬酸根3- 酒石酸根3- F- IO-3 H2PO-4 SO-4 CH3COO- Cl- ClO-3 Br- NO-3 ClO-4 I- CNS-; 对阳离子排序为： Th4+ Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+ NH4+ K+ Na+ Li+5 盐析法结论：a不同种类的盐主要影响Ks；b 离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好无机盐的挑选原则： a 较高的盐析效能；b高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液；c溶解度受温度的影响小；d盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离；e不易引起蛋白质的变性；f价格低廉；最常用(NH4)2SO4优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液pH降低，在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。

次常用Na2SO4缺点：在400C以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白5 盐析法B、无机盐添加方式5 盐析法C、温度T主要考虑不能影响主要产物的活力,即在其稳定的温度下盐析,可通过实验决定,一般来说,温度越低,形成沉淀越不易,但也有相反的情况.实际上,盐析的温度范围较大,所有一般都在常温下盐析.5 盐析法D、溶液pHpH影响Cohnx方程中的值见图图有何用？6 等电点沉淀法 等电点沉淀法中的pH值作用于值而隐含在Cohnx公式中，pI值通常在pH46范围内变化，一般用无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸）作沉淀剂在蛋白质疏水性比较大和结合水比较小时这种类型的沉淀更有效为了提高等电点法的沉淀能力，常将其与盐析法、有机溶剂法或其他沉淀法一起使用最大缺点：无机酸会引起较大的蛋白质不可逆变性的危险7 有机溶剂沉淀法 同盐析一样，随着沉淀剂有机溶机浓度的上升，蛋白质溶解度也呈指数规律下降 式中, So为当（K/e2） 0时S的外推值；e为水-有机溶剂混合物的介电常数；K为常数(水的介电常数的吸收系数)7 有机溶剂沉淀法 有机溶剂的种类：丙酮(首选)、乙醇、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀pro机理：A、有机溶剂沉淀法的机理是加入溶剂后，会使水溶液的介电常数降低，而使pro分子间的静电引力（库仑力）增大，导致凝集和沉淀。

B、有机溶剂使pro溶剂化，使原来与pro结合的水被溶剂所取代，从而降低了pro溶解度这种理论不能说明为什么乙醇比丙酮的亲水性强，丙酮却比乙醇沉淀pro的能力强，也解释不了丙酮、乙醇之类溶剂在所谓脱去pro水膜的过程中容易造成pro变性，而盐析脱水时不造成pro变性C、丙酮、乙醇等不仅是pro的沉淀淀剂，而且还是一种变性剂，可见作用有机溶剂使pro在沉淀和变性之间既有区别又相关联7 有机溶剂沉淀法 影响因素及控制A、T：当乙醇与水混合时，会放出大量的稀释热，使溶液T显著升高，对不耐热的pro影响较大解决办法：搅拌、少量多次加入，以避免温度骤然升高损失pro活力另一方面温度还会影响有机溶剂对pro的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全，所以在乙醇沉淀人血浆蛋白时，温度控制在-10C下进行B、乙醇：通常随乙醇上升，pro溶解度下降如血纤维蛋白原的最大溶解度在乙醇浓度为8%时达到最大，而当乙醇浓度为40%时达到最小C、pH值：在确定了乙醇以后，pro最低溶解度出现在蛋白.的pI处，因此可以通过调节pH值来选择性分离蛋白质D、pro：避免使用很稀的浓度，因pro在高浓度下才较稳定7 有机溶剂沉淀法优点：A、某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽，所得产品的纯度较高，B、从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂；缺点：A、耗用大量溶剂，而溶剂来源、贮存都比较困难麻烦；B、且沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性；C、收率也比盐析法低；D、试剂易燃，有毒。

8 非离子型聚合物沉淀法 某些聚合物，如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等，具有沉淀蛋白质的作用其中最常用的是PEG，相对分子质量从200D到20KD的不同聚合程度的产品都是有效的，通常在蛋白质沉淀中使用PEG-6000或PEG-4000计算公式：式中，S-溶解度；c-PEG浓度；-常数，受溶液条件的影响(如pH值和离子强度)；K-常数，由pro大小和PEG的类型决定 适应条件：上式适用性广，但在低浓度蛋白质，如1.5g/L和高浓度蛋白质，如75g/L和150g/L时，实验结果会偏离线性这时方程需校正8. 非离子型聚合物沉淀法 8. 非离子型聚合物沉淀法优点：A、体系的温度只需控制在室温条件下；B、沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集；C、PEG非但不会使pro变性,而且可以提高它的稳定性；D、PEG无毒，优先使用在临床产品的加工过程中被缺点：A、PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去为此需用超滤和液-液萃取来解决；B、价格较昂贵 9. 沉淀动力学 溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值的降低是一个动力学过程当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚集作用通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：A、热运动（Brownian运动）；B、对流运动，由机械搅拌产生；C、差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。

第A、B两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，第种机理在沉降过程中起主导作用(如在废水处理中)异向聚集：由Brownian运动所造成的碰撞导致同向聚集：而由对流运动所造成的碰撞导致9. 沉淀动力学 沉淀过程步骤：A、初始混合，蛋白质溶液与沉淀剂在强烈搅拌下混合；B、晶核生成，新相形成，产生极小的初始固体微粒；C、扩散限制生长，晶核在Brownian扩散作用下生长，生成亚微米大小的核，这一步速度很快；D、流动引起的生长，这些核通过对流传递（搅拌）引起的碰撞进一步生长，产生絮体或较大的聚集体，这一步是在较低的速度下进行的E、絮体的破碎，破碎取决于它们的大小、密度和机械阻力F、聚集体的陈化，在陈化过程中，絮体聚得大小和阻力平衡 10 Applications早在50年前，Edwin Cohnx及其合作者就是用乙醇来完成蛋白质沉淀经典实验的他们应用低温乙醇分级沉淀人血浆的办法制备了白蛋白溶液，并通过冷冻干燥将乙醇从成品中去除，所得产品成功地救治了1941年珍珠港空袭后的幸存者除此以外，免疫球蛋白、血纤维蛋白原等其他许多蛋白质都是利用上述方法进行沉淀的。