中性粒细胞分离实验步骤.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑中性粒细胞分离实验步骤 中性粒细胞分开测验步骤 一、中性粒细胞初步分选 试剂与耗材：人淋巴细胞分开液、RP16４0、1５mｌ离心管4支,棉球,止血带、碘伏、采血针,５mlEＤTA抗凝采血管2支1mｌ枪及枪头. 分开步骤: 1.全体试剂恢复至室温; 2.EDTA抗凝采血管收集人外周血10mｌ; 3.分别将5mｌ外周血参与５mｌ人淋巴细胞分开液中（15ml离心管中举行)； 留神动作轻柔缓缓参与; 4.５00g离心,3０-３5分钟,室温； 5.离心后收集低带中性粒细胞，分两层,第一层为单核细胞,其次层为中性粒细 胞;(若离心后分层不明显那么多离心5—10分钟) 6.将RP１6４０用纯水稀释为50％RP１64０用于重悬中性粒细胞,恢复细胞活 性5-１0分钟) 7.４00g离心10分钟,去上清，收集中性粒细胞，重悬于ＲP16４0中,细胞计数 二、中性粒细胞磁珠分选 试剂耗材及设备：磁力分选器,磁柱，CD15磁珠试剂盒，磁珠分选缓冲液50ml，RP1６４０，1ｍl枪及枪头,２0微升枪与枪头,１5ｍl离心管4支，细胞计数板。

步骤: 1.制冰,保证磁力分选器可以放入冰盒内操作，在４—8℃内举行分选； 2.配液磁珠分选缓冲液（50ml PBS液中含2mmｏl/L EDＴA,０.5%BＳA，P Ｈ=72); 3.将上步初步分选的中性粒细胞悬液300g离心10分钟，去上清; 4.细胞重悬于磁珠分选缓冲液中，１0７细胞重悬于80微升缓冲液中；(如细胞 数多按倍数增加) 5.10７细胞中参与20微升ＣD15磁珠;充分混匀放入２—８℃避光孵育１5分钟; 6.用1—2ｍl缓冲液洗涤细胞／107细胞，300g离心10分钟,去上清； 7.重悬细胞于缓冲液中,108细胞重悬于5０0微升缓冲液中; 8.将磁力分选器置于冰盒中,用３ｍｌ缓冲液冲洗磁柱; 9.将含有中性粒细胞的缓冲液参与磁柱中; 10.用缓冲液冲洗磁柱，每次３ml,冲洗3次; 11.除去磁场,把磁柱放置于１5ｍｌ离心管上，用5ml缓冲液加压快速冲洗磁柱; 12.离心管中收集的便是中性粒细胞； 13.30０g离心去上清，重悬细胞于1０ml细胞培养液中,细胞计数 三、细胞活力检测 中性粒细胞分开测验步骤 步骤： 1、4%台盼蓝母液：称取4ｇ台盼蓝,加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至1０0ml，用滤纸过滤4度保存。

使用时.用PＢS稀释至０.４％. 2、胰酶消化贴壁细胞,制备单细胞悬液,并作适当稀释. ３、染色：细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9：1混合混匀终浓度0．０4％) 4、计数:在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞 ５、镜下查看,死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色通明状 6、统计细胞活力:活细胞率（％)= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数)×１０0% 四、细胞分组铺板给药 试剂耗材及设备:六孔板2个，1ml枪及枪头,２0微升枪与枪头，１５ml离心管4支，细胞计数板. 1. 10ml外周血约莫可分出1×107个细胞； ２．分为10组： ①空白组②单ＰI组③单A V组 ④ＰI、AＶ双染组⑤ＰI、A V、CD15三染组 ⑥ＬＰS１μｇ/ｍl组⑦LＰS+Nec—1 50μg/ｍl组⑧LPS+Nｅc-1 5μｇ/mｌ组 ⑨Neｃ-1 50μg／mｌ组⑩Ｎｅc—１5μg/ml组. 3铺板,每孔1mｌ细胞悬液，给药,空白组赋予DMSO.（LPS浓度选择1μｇ/ｍl,由于此浓度刺激中性粒细胞后展现凋亡率较低,坏死率较高Ｎec－１浓度作用于神经细胞为7μｇ／ml—50μg／mｌ） 五、细胞凋亡率检测 耗材试剂：1ml枪及枪头,20微升枪与枪头,1.5mｌ离心管15个，凋亡检测试剂盒,CD15抗体. １．细胞培养一段时间后（3、6、12、2４、36小时)，离心(20０0ｒpm离心5min）收集细胞; 2. 用PBS 洗涤细胞二次(200０rpｍ离心5min）收集1~5×１0５细胞; 3. 参与500μL 的BinｄiｎｇBuffeｒ悬浮细胞； 4．参与5μL A V 混匀后，参与5 μL PI,混匀; ５．室温、避光、回响５~15ｍin； 6．上机检测,分析结果。