抑制血清应答因子表达影响转化生长因子β1介导的食管癌上皮细胞-间质转化的作用研究.docx

抑制血清应答因子表达影响转化生长因子β1介导的食管癌上皮细胞-间质转化的作用研究上皮间质转化在肿瘤的发生、发展中起到了重要的调节作用，与肿瘤的增殖、迁移和侵袭，复发和预后不良关系密切，也是肿瘤放化疗耐药的重要因素[1]体内外研究均发现，EMT的发生多提示食管癌预后不良，促进肿瘤进展，使食管癌细胞迁移和侵袭能力增加[2,3]研究表明，血清应答因子在肿瘤中的高表达与EMT关系密切，其作为转录因子能够下调E-钙黏蛋白的表达[4]，同时亦能够调节下游靶蛋白α-平滑肌肌动蛋白的表达并促进EMT的形成[5]本课题组前期研究也发现，SRF在食管癌组织中的异常高表达，采用基因沉默方法降低SRF的表达，则能够有效的在体外抑制食管癌细胞的增殖[6]因此本研究于2019年1—12月拟采用转化生长因子β1在体外诱导Eca-109食管癌细胞发生EMT，并观察基因沉默SRF对其的干预效应，为开发食管癌新的基因治疗提供初步的实验依据1、材料与方法1.1主要试剂Eca-109食管癌细胞购置于中科院上海细胞库；DMEM培养基、胎牛血清购置于美国GIBIO公司；TGF-β1购置于美国peprotech公司；SRF、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、GAPDH购置于美国santacruz公司；α-SMA购置于英国abcam公司；小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siR-NA）产品购置于广州锐博生物科技有限公司。

1.2方法1.2.1细胞培养及转染Eca-109细胞用含体积分数为10%胎牛血清的1640培养基，置于37℃，5%二氧化碳孵育箱中培养待细胞次融合状态后，实验分组为：（1）阴性对照siRNA组：阴性对照siRNA转染6h，更换无血清培养基24h;(2)TGF-β1+阴性对照siRNA组：阴性对照siRNA转染6h，更换含5ng/mLTGF-β1诱导24h;(3)TGF-β1+SRF-siRNA组：SRF-siRNA转染6h后，更换含5ng/mLTGF-β1诱导+SRF-siRNA按照转染手册步骤进行，每25平方厘米细胞培养瓶加入50nmol/mL脂质体转染试剂和10μLsiRNA阴性对照或SRF-siRNAsiR-NA阴性对照序列：正向序列：5′-UUCUCCGAACGU-GUCACGUTT-3′，反向序列：5′-ACGUGACAC-GUUCGGAGAATT-3′；SRF-siRNA序列：正向序列：5′-GCAAGGCACUGAUUCAGACTT-3′，反向序列：5′-GUCUGAAUCAGUGCCUUGCTT-3[6]1.2.2细胞划痕实验将Eca-109细胞按照6000个/孔种植于24孔板，待细胞贴壁密度为80%时用200μL枪头划痕，按照实验分组诱导48h，分别于0h和48h在相同位置拍照，采用IPP6.0图像分析软件测量划痕区域面积，并计算迁移百分比，即（0h面积-48h面积）/0h面积×100%。

1.2.3免疫细胞化学染色常规制备细胞玻片，高压修复及封闭内源性过氧化物酶后，一抗E-钙黏蛋白（1∶200)4℃过夜，二抗37℃孵育20min,DAB显色，镜下控制，苏木素轻度复染，中性树胶封片1.2.4蛋白质印迹法采用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度按照20微克/泳道上样，13%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜；E-钙黏蛋白、SRF、N-钙黏蛋白、α-SMA、GAPDH一抗（1∶1000)4℃过夜，二抗（1∶3000)37℃孵育45min,ECL发光采用IPP6.0图像分析软件测定条带光密度值，以相应内参（GAPDH）的比值作为该蛋白的相对表达量1.3统计学方法采用SPSS13.0统计学软件，数据以表示多组间采用完全随机设计的单因素方差分析，多重比较方差齐采用LSD-t检验的方法，P<0.05为差异有统计学意义2、结果2.1SRF基因沉默抑制TGF-β1介导的Eca-109食管癌细胞的迁移能力如图1所示，方差分析结果显示（F=105.462,P<0.001），方差齐（F=1.519,P=0.293）采用LSD-t检验，与阴性对照siRNA组（10.00±2.00）%相比较，TGF-β1+阴性对照siRNA组的迁移百分比为（50.67±4.73）%，差异有统计学意义（P<0.001）；与TGF-β1+阴性对照siRNA相比较，TGF-β1+SRF-siRNA组细胞迁移百分比为（29.00±3.00）%，差异有统计学意义（P<0.001）。

2.2SRF基因沉默抑制TGF-β1介导的Eca-109食管癌细胞的EMT进程如图2所示，免疫细胞化学染色结果显示，E-钙黏蛋白阳性表达于细胞膜，阴性对照siRNA组可见明显的E-钙黏蛋白膜阳性表达，TGF-β1+阴性对照siRNA组E-钙黏蛋白膜阳性表达减少，与TGF-β1+阴性对照siRNA组相比较，TGF-β1+SRF-siRNA组E-钙黏蛋白膜阳性表达增多如图3、表1所示，蛋白质印迹法结果显示，与阴性对照siRNA组相比较，TGF-β1+阴性对照siRNA组E-钙黏蛋白表达下调（P<0.001），而N-钙黏蛋白、SRF、α-SMA蛋白表达上调（均P<0.001）；与TGF-β1+阴性对照siRNA组相比较，TGF-β1+SRF-siRNA组E-钙黏蛋白表达上调（P=0.001），而SRF、N-钙黏蛋白、α-SMA蛋白表达下调（P<0.001;P=0.001;P=0.003），经方差分析（LSD-t检验），两两比较均差异有统计学意义（P<0.05）3、讨论目前研究发现，SRF在多种肿瘤中，包括甲状腺癌[7]、肝癌[8]、胃癌[9]等多种肿瘤中异常高表达，并与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力有关[10,11,12]。

SRF能够与miR-199a-5p启动子结合并促进其转录，而miR-199a-5p则能够与E-钙黏蛋白mRNA结合从而抑制其表达[4]采用TGF-β1诱导Eca-109食管癌细胞，能够显著促进其迁移和侵袭能力，下调E-钙黏蛋白的表达，上调间质表型包括N-钙黏蛋白、波形蛋白（Vimentin）、Slug等蛋白的表达，同时通过上调细胞周期蛋白D1的表达从而促进了Eca-109细胞的增殖[13]本课题组前期研究也发现，基因沉默SRF能够下调β-连环蛋白、细胞周期蛋白D1的表达，同时上调E-钙黏蛋白的表达，从而抑制了Eca-109食管癌细胞的增殖和侵袭能力[6]在本研究中也发现，TGF-β1能够显著上调SRF的表达，同时促进Eca-109食管癌细胞的迁移能力的提高，同时减少细胞间紧密连接蛋白（E-钙黏蛋白）的表达，并促进间质表型（N-钙黏蛋白、α-SMA）的改变，诱导了食管癌细胞发生EMT基因沉默SRF则能够显著抑制TGF-β1诱导的Eca-109食管癌细胞发生EMT，并降低了其迁移能力表1血清应答因子（SRF）基因沉默对E-钙黏蛋白、SRF、N-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白表达的影响/注：与阴性对照小干扰RNA(siRNA）组相比较，aP<0.05；与转化生长因子β1(TGF-β1）+阴性对照siRNA组相比较，bP<0.05图3血清应答因子（SRF）基因沉默对E-钙黏蛋白、SRF、N-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白表达的影响（蛋白质印迹法）注：NC为阴性对照，siRNA为小干扰RNA,TGF-β1为转化生长因子β1SRFE-SRFN-图1血清应答因子（SRF）基因沉默对转化生长因子β1(TGF-β1）介导的Eca-109食管癌细胞迁移的影响（细胞划痕实验）注：siRNA为小干扰RNASRF及其转录辅因子心肌相关转录因子是调节肌动蛋白的重要转录因子，在细胞黏附、细胞收缩、细胞骨架蛋白、细胞外基质等方面发挥了重要的调控作用，能够与α-SMA基因启动子结合并促进其转录[14,15,16,17]。

在肿瘤研究中，α-SMA常作为肿瘤相关成纤维细胞或EMT标记物，与肿瘤进展和转移有关[18]本研究结果也显示，在TGF-β1诱导的Eca-109食管癌细胞EMT过程中，伴随了α-SMA表达的上调，而予以基因沉默SRF，能够显著抑制Eca-109食管癌细胞α-SMA的表达其他研究也显示，在体外沉默SRF，能够显著抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，并能够抑制EMT进程[19]综上所述，SRF在食管癌发生、发展中起到了较为重要的调节作用，可能是基因靶向治疗的一个潜在靶点本文图2见插图9-4)图2E-钙黏蛋白在Eca-109食管细胞中的阳性表达（免疫细胞化学染色×400)注：siRNA为小干扰RNA,TGF-β1为转化生长因子β1,SRF为血清应答因子何喜,王志强,林韬,胡万宁,张明明.抑制血清应答因子表达影响转化生长因子β1介导的食管癌上皮细胞-间质转化的作用研究[J].安徽医药,2020,24(09):1768-1771+1912.基金:河北省科技计划项目(17277749D).。