westernblotting实验操作步骤讲解.docx

蛋白免疫印迹杂交（ Western Blot, WB ）WB 是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分别，再转移到杂交膜上， 然后通过一抗 /二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法； WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一；以下是总结 Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于胜利完成 WB ；A 第一部分：蛋白样本提取制备蛋白样品制备是 Western Blotting的第一步， 更是打算 WB 成败的关键步骤， 总体原就和留意事项：1. 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 （通过采纳不同提取方法或挑选不同的试剂盒产品）；2. 保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的 pH 、盐浓度、表面活性剂、仍原剂等的挑选）；3. 提取过程防止蛋白降解、集合、沉淀、修饰等， （低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；4. 尽量去除核酸， 多糖， 脂类等干扰分子 （通过加入核酸酶或实行不同提取策略）；5. 样品分装，长期于 -80℃中储存，防止反复冻融；方法的挑选自行配制抽提试剂，依据文献方法或体会提取 ；购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取 ；Example 1 ：试验中提取肾脏总蛋白，详细试验过程如下：1. 提前一天 4℃解冻 RIPA，肯定要完全融解；配 PBS（用于细胞试验就需高压） ；2. 配制裂解液： PMSF:RIPA=1:99,PMSF 终浓度为 100mM（依据样本数配制所需 的量，临用临配）；3. 裂解组织：每个样品称取 100mg，加 1ml 裂解液，匀浆后 4℃静置 2h 使其充分裂解， 14000g，4℃离心 10min，取上清；4. 蛋白定量：取少量上清稀释 30 倍蛋白定量，然后运算出各样本原液蛋白浓度； 留意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用 Bradford 法，可以选用改良的 Lowry ’s 法或者 BCA 法；5. 样品蛋白浓度均一化：依据蛋白定量运算的结果将各样品蛋白浓度调整一样；详细方法为加入 PBS 稀释至样品浓度一样，本次蛋白浓度为 3mg/ml ；6. 分装并存于 -80℃，防止反复冻融；B 其次部分：相关试剂的配制：1. 10% 的 SDS（戴口罩称取）：称取 SDS10g，先加双蒸水 80ml ，再用磁力加热搅拌助溶，然后定容至 100ml； 室温储存，如在长期储存中显现沉淀，可在 50℃水浴溶化后，仍可使用；2. 1.5M Tris/HCL （ pH8.8）Trisbase 18.17g，溶解于 80ml 双蒸水，用浓盐酸调 pH 至 8.8，最终定容至 100ml，室温下储存；3. 0.5M Tris/HCL （ pH6.8）Trisbase 6.06g，溶解于 80ml 双蒸水，用浓盐酸调 pH 至 6.8，最终定容至 100ml， 室温下储存；4. 30% 丙烯酰胺 /0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺丙烯酰胺（ Acr） 75g甲叉双丙烯酰胺 2g加双蒸水 150ml，37℃加热溶解后，定容至 250ml，查证该溶液 pH 应不大于7.0，4℃棕色瓶储存；使用时复原至室温且无沉淀；Be careful...：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸取， 其作用具有累积性；称量丙烯酰胺和 N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和口罩；可认为聚丙烯酰胺 无毒，但也应谨慎操作，由于它仍可能含有少量未聚合材料；5. 上样缓冲液0.5mM Trisbase〔pH6.8〕 2.5ml甘油 2.0ml10％SDS 4.0ml0.4%溴酚蓝（ mw669.97） 1ml 二巯基乙醇（ mw78.14） 0.5ml 注：配好后分装 -20℃储存；6. 电泳缓冲液10 倍储存液 1 倍应用液Trisbase 30g 3g甘氨酸 144g 14.4g SDS 10g 1g加水至 1000ml，PH 值用 HCl 调 8.3；已经配制了 1000ml 的储存液；电泳缓冲液用应老师的电泳槽应用液 300ml；用 10 倍的储存液 30ml 加入水 270ml；7. 转移缓冲液（临用临配，铁盒子里搅拌混匀并 4℃预冷）：0.606g2.88g160402002.424g11.52g640160800Tris base 甘氨酸 H2O（ml ） 甲醇（ ml ） 终体积（ ml）2 板胶转移缓冲液的用量约为 200ml；8. 洗涤缓冲液（ TBS）10 倍储存液1 倍应用液Tris base24.2g2.42gNaCl80g8g加水 800ml，用 HCL 调整 PH 为 7.6，再加水至 1000ml，已经配制了 1000ml 的 TBS 液，临用时再加 0.1%的 Tween-20；一般做两板胶要用洗涤缓冲液 500ml； 用储存液 50ml 加入 450ml 水，后加 0.5ml Tween-20；9. 封闭缓冲液（ 5% 脱脂奶粉）— 10ml/膜脱脂奶粉 2g洗涤缓冲液 40ml两板胶 4 张膜要用封闭缓冲液 40ml；详细试验步骤：预备：预备器材： 10%过硫酸铵；冰盒；预热恒温加热器；拿出试剂（双丙和 TEMED提前从冰箱拿出平稳，否就凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡）；电泳仪器； 洗洁净的板子和梳子； 滤纸条用于吸水； 剪刀；尺子；剪好的膜（依据目的蛋白分子量以及样品个数打算）及比膜稍大些的洁净滤纸；脱脂奶粉；洁净的装封闭液的容器约 50ml 大小；提前清洗玻璃板并晾干：留意不要用清洁球之类的粗糙物品清洗玻璃板，可用洗洁精泡约 2h，用自来水冲洗后再用蒸馏水冲洗洁净，置于架子上晾干；做胶分别胶：1. 先称取过硫酸胺，配两板胶用 10％的过硫酸胺 150μl ，一般要称取过硫酸胺 0.2--0.3mg，溶解到相应量的双蒸水中，混匀；分别胶（括号里为 2 板胶的用量）试剂 7.5％ 10％ 12％ 15％ 水〔ml〕 4.9 〔7.35〕 4.1〔6.15〕 3.4〔5.1〕 2.4〔3.6〕〔ml〕1.5MTris/HCl〔pH=8.8〕2.5〔3.75〕2.5〔3.75〕2.5〔3.75〕2.5〔3.75〕丙/双丙烯酰胺2.5〔3.75〕3.3〔4.95〕4.0〔6.0〕5.0〔7.5〕10%SDS 100,〔150〕 100,〔150〕 100,〔150〕 100,〔150〕10%过硫铵〔 μl〕50,75 50,75 50,75 50,75TEMED 10,15 10,15 10,15 10,15适用蛋白分子量 ＞100kDa 60-100kDa 20-60kDa ﹤20kDa玻板间夹上胶条，用夹子将两块玻板夹紧；按以上方法配胶，加入 TEMED 后立刻摇匀即可灌胶；灌胶时，可用 10ml 枪吸取 5ml 胶沿玻璃放出，将胶加入到玻璃板的夹层中；加入的量略高于夹子的最高处（或者胶面升到绿带中间线高度时即可）加好后加入 1ml 的水压胶；做分别胶时，凝固时间大约为 25－40 分钟，要依据温度来确定；一般可以依据剩下在离心管中的胶的凝固情形来确定胶的凝固；当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了；再等 3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干；留意：旧的 1.0mm 的板子短的玻璃在里面，新的在外面；过硫酸铵一般现配现用；留意各种试剂加入的次序， “三大三小”，后面加过硫酸铵，最终加 TEMED ；配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶显现浓度不均的情形；要依据温度调整 TEMED 的使用量；夏天凝聚的快，冬天凝聚的慢；冬天假如凝聚的慢，两板胶可以加 TEMED 20-30μ l；水封的时候水要渐渐加入，太快会导致胶面不平，封胶后切记勿动；胶通常在 0.5～ 1h 内凝集最好，过快胶太硬易龟裂，而且电泳时简单烧胶；下一步试验预备a 预备样品：1． 预热微量恒温器（ 98℃）；2． 预备一套中 EP 管并标记 ，以用于混匀样品和上样缓冲液；3． 取出样品，marker，上样缓冲液 置于冰上；4． 样品：上样缓冲液 =3:1 混匀，置于微量恒温器上 98℃ 5min 变性；b 配制电泳缓冲液；c 配 4％浓缩胶， TEMED 临用时加；浓缩胶（括号里为 2 板胶用量）水3.00ml〔4.5ml〕0.5MTris/HCl〔PH=6.8〕1.25ml〔1.875ml〕丙/双丙烯酰胺（30%/0.8%）0.67ml〔1.005ml〕10%SDS50μl〔75μl〕过硫酸胺（ 10％）50μl〔75μl〕TEMED5μl〔15μl〕胶凝固后， 快速向上将梳子拔下， 将玻璃板夹上电泳架， 完整的玻璃板在外围；电泳槽中倒入电泳缓冲液（约 300ml）；加足够的电泳液后开头预备上样； （电泳液至少要漫过内侧的小玻璃板） ；留意：浓缩胶的加入很重要，由于其硬度比分别胶小，而且仍要加入梳子，把握其凝固的时机很重要；太迟胶要粘住梳子，太早胶凝固不好；用 Bio-Rad 的玻璃板用TEMED 15 μl ，在温度为 22℃时凝固的时间为 10 分钟左右， 温度再高一些可以达到8~9 分钟，低一些可以延长一些；胶的凝固很快，主要是加入 TEMED 后的动作要快速，以免在离心管中凝固了；加入的量要与玻璃板的最高线平行；灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生；插梳子时要使梳子保持水平；由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶（其实说常常有点过了，补 1~2 次就行了，不补胶问题也不大） ；待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出；插梳子要用力匀称，一次成型，且要留意梳子插入时哪面朝内哪面朝外；加样（加变性后的样品）：用微量进样器或加样吸头吸入样品 20μl，加入到加样孔中；用微量进样器贴壁吸取样品， 将样品吸出时不要吸进气泡； 将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品；（加样太快可使样品冲出加样孔， 如有气泡也可能使样品溢出； ）加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3 次，以免交叉污染；在第一孔和最终一孔加 20μl 上样缓冲液以防止边缘效应， 其次孔加 3μl marker，其他孔加 20μl 样品（样品加样 20-30 μl 都可以，但不超过 30μl, 加样量取决于蛋白浓 度），保证每个上样孔蛋白浓量为 30-50 μg；电泳：100V，电泳 2 小时，电泳时要留意电泳槽上的电泳缓冲液的量，较少时，要从下槽中吸取一部分转移到上槽；有时电泳的时间用不到 2 小时，要依据溴酚蓝的位置确定是否要停止电泳；通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处邻近即可停止电泳；转膜：蛋白因结合 SDS 而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜操作根椐电转仪制造商的说明书进行转膜方式分为半干和湿转两种，半干式转膜速度快，而湿式成 功率高并特。