利用肠黏膜基因组差异表达研制抗应激添加剂讲课文档.ppt

利用肠黏膜基因组差异表达研制抗应激添加剂利用肠黏膜基因组差异表达研制抗应激添加剂第一页，共四十八页利用肠黏膜基因组差异表达研制抗应激添加剂第二页，共四十八页汇报提纲& 研究背景、目的研究背景、目的& 研究技术路线与方法研究技术路线与方法& 结果与分析结果与分析& 结论结论& 有待进一步研究的问题有待进一步研究的问题第三页，共四十八页一、研究背景及目的u应激应激u夏季高温对养猪生产的影响夏季高温对养猪生产的影响u高温与胃肠道损伤修复高温与胃肠道损伤修复u基因芯片在猪热应激中的应用基因芯片在猪热应激中的应用第四页，共四十八页应激的种类应激的种类饲管因素运输因素环境因素防治因素中毒因素心理因素其他因素随着全球性气候变暖，高温成为对家畜作用最广泛和不可避免的应激因随着全球性气候变暖，高温成为对家畜作用最广泛和不可避免的应激因素人工气候室高温模型符合试验因子单一化研究应激机制人工气候室高温模型符合试验因子单一化研究应激机制第五页，共四十八页热应激热应激l环境温度超过猪的等热区上限，猪体温超过39.5，产热大于散热免疫机能免疫机能生产性能生产性能经济损失经济损失生理指标生理指标行为改变行为改变胃肠道损伤胃肠道损伤第六页，共四十八页。

应激与应激性溃疡l应应激激性性溃溃疡疡：应应激激中中机机体体为为了了保保护护心心、脑脑等等重重要要器器官官，全全身身血血液液重重新新分分配配，胃胃肠肠道道血血流流量量明明显显减减少少导导致致小小肠黏膜急性损伤，因此，肠道是应激反应的中心器官肠黏膜急性损伤，因此，肠道是应激反应的中心器官第七页，共四十八页高温与肠黏膜屏障的损伤修复 小肠黏膜屏障结构的完整性小肠黏膜屏障结构的完整性免疫功能免疫功能第一道防御屏障第一道防御屏障生产性能生产性能营养物质吸收利用营养物质吸收利用第八页，共四十八页基因芯片在猪热应激中的运用基因芯片在猪热应激中的运用基因芯片（基因微阵列）基因芯片（基因微阵列）cDNAmicroarrayAffymetrix GeneChip Porcine Genome Array，包包含含23,937个探针组，代表个探针组，代表20,201个基因应应用用猪猪全全基基因因组组已已知知核核酸酸序序列列作作为为探探针针与与互互补补的的靶靶核核苷苷酸酸序序列列杂杂交交，对对23937个个探探针针以以及及杂杂交交信信号号进进行行灵灵敏敏、准准确确的的检检测测分分析析，实实时时同同步步高高通通量量评评价价猪猪的的热应激反应。

热应激反应第九页，共四十八页实时实时同步同步高通量高通量评价猪的热应激评价猪的热应激基因芯片基因芯片热应激热应激从从猪猪热热应应激激及及中中药药两两个个角角度度对对多多参参数数实实时时同同步步分分析析，探探讨讨热热应应激激机机制制并并发掘药物靶点，为多层次评价中药作用提供工具发掘药物靶点，为多层次评价中药作用提供工具改善环境改善环境营养调控营养调控抗热应激药物抗热应激药物（中药添加剂）（中药添加剂）中药中药第十页，共四十八页研究目的、意义通通过过猪猪在在人人工工气气候候室室连连续续10天天26-40的的循循环环变变温温刺刺激激，从从小小肠肠黏黏膜膜形形态态学学、与与损损伤伤修修复复相相关关的的EGF/EGFR等等生生长长因因子子与与mRNA水水平平以以及及信信号号通通道道等等方方面面探探讨讨高高温温对对猪猪小小肠肠黏黏膜膜结结构构损损伤伤的的影影响响及及中中药药调调控控机机制制，为为开开发发抗抗热热应应激激中中药药添添加剂以及小肠损伤修复剂奠定基础加剂以及小肠损伤修复剂奠定基础第十一页，共四十八页二、技术路线和方法二、技术路线和方法l l实验动物：实验动物：实验动物：实验动物：4848头头头头2 2月龄、体重月龄、体重月龄、体重月龄、体重7.150.61kg7.150.61kg的中国实验用小型猪（的中国实验用小型猪（的中国实验用小型猪（的中国实验用小型猪（CEMP,CEMP,农大农大农大农大I I系）。

系）l l人工气候室：中国农科院畜牧兽医研究所动物营养国家重点开放实验室人工气候室：中国农科院畜牧兽医研究所动物营养国家重点开放实验室人工气候室：中国农科院畜牧兽医研究所动物营养国家重点开放实验室人工气候室：中国农科院畜牧兽医研究所动物营养国家重点开放实验室l l石石石石香香香香颗颗颗颗粒粒粒粒：功功功功效效效效为为为为防防防防治治治治高高高高温温温温引引引引起起起起的的的的机机机机体体体体免免免免疫疫疫疫力力力力下下下下降降降降及及及及生生生生产产产产性性性性能能能能下下下下降降降降其其其其中中中中盐盐盐盐酸酸酸酸小小小小檗檗檗檗碱碱碱碱含含含含量量量量1.0mg/g1.0mg/g用法：饮水；用量：用法：饮水；用量：用法：饮水；用量：用法：饮水；用量：0.15g/kgbw0.15g/kgbw连用1010天 主主主主要要要要药药药药味味味味包包包包括括括括苍苍苍苍术术术术( (Rhizoma Rhizoma AtractylodisAtractylodis) )、藿藿香香( (Herba Herba AgastachisAgastachis) )、黄黄柏柏( (Cortex Cortex PhellodendriPhellodendri) )、石膏、石膏( (Gypsum FibrosumGypsum Fibrosum) )等。

等第十二页，共四十八页退热及中枢镇痛作用增强巨噬细胞吞噬功能增强细胞和体液免疫功能抗菌、镇痛、解热作用促进胃液分泌，解除胃肠痉挛燥湿健脾用于脘腹胀满，泄泻，水肿.调节胃肠运动，调节黏膜免疫抗病原微生物、抗溃疡作用、抗菌、清热燥湿免疫调节作用苍术藿香黄柏石膏石香颗粒石香颗粒第十三页，共四十八页技术路线21000，41000个基因个基因猪热应激模型猪热应激模型大鼠热应激模型大鼠热应激模型模型评价模型评价小肠形态结构观察小肠形态结构观察基因芯片分析基因芯片分析关键的调节因子关键的调节因子相关性分析相关性分析IEC-6细胞热应激模型细胞热应激模型细胞形态、活力、凋亡细胞形态、活力、凋亡生长因子表达变化生长因子表达变化ERK1/2信号通路的变化信号通路的变化相关性分析相关性分析10个生长因子和个生长因子和ERK1/2信号通路信号通路第十四页，共四十八页技术路线技术路线小肠形态学观察小肠形态学观察高高温温组组体内体内体外体外生产性能生产性能生理指标生理指标肠上皮细胞肠上皮细胞组织学观察组织学观察IEC-6形态学观察形态学观察ERK1/ERK2细胞活力细胞活力/细胞周期细胞周期中中药药组组对对照照组组损伤指标观察损伤指标观察临床观察临床观察基因芯片评价基因芯片评价生长因子生长因子mRNA信号通道信号通道Pathway Pathway 分类分类EST分析分析功能分析（功能分析（GOGO分类）分类）高通量快速筛选平台高通量快速筛选平台第十五页，共四十八页。

三 结果与分析NameAvg. TemperatureMin. TemperatureMaxTemperatureStandard DeviationEmissivityControl35.4C27.4C38.3C0.740.95Heat Stress37.4C28.9C39.5C0.580.95（一）高温模型及对猪小肠黏膜形态结构的损伤及中药的修复作用高温模型及对猪小肠黏膜形态结构的损伤及中药的修复作用第十六页，共四十八页热应激前后猪肛温变化热应激前后血清皮质醇变化第十七页，共四十八页直肠温度及平均日增重直肠温度及平均日增重Table.Rectaltemperatureandaveragedailygain注：同行小写字母相同者代表组间差异不显著；不同者代表组间差异显著注：同行小写字母相同者代表组间差异不显著；不同者代表组间差异显著(P 0.05)(P 0.05)第十八页，共四十八页热应激猪小肠黏膜的形态学变化 左列为对照组左列为对照组 中中列为高温组列为高温组 右列右列为中药组为中药组 上行为十二指肠中上行为十二指肠中行为空肠行为空肠下行为回肠下行为回肠 第十九页，共四十八页高温对猪空肠上皮细胞结构的影响 A为对照组，B为高温组；10000 电镜显示，小肠微绒毛变短；细胞核没有明显变化；线粒体、转运小泡及次级溶酶体数量增加。

50000电镜显示空肠上皮细胞内线粒体数量增加，线粒体内部脊突变短，肿胀，内部已有空泡形成；次级溶酶体数量增加，从形态上显示，膜包被的电子密度不同的多胞体结构清晰可见；在没有脱落的空肠上皮细胞间紧密连接以及细胞核没有明显变化5000010000第二十页，共四十八页热应激猪空肠组织基因表达谱变化热应激猪空肠组织基因表达谱变化对照组对照组高温组高温组RNARNA提取提取反转录反转录cDNAcDNAcRNAcRNA合成合成芯片杂交芯片杂交生物学分析生物学分析芯片验证芯片验证ESTEST分析分析GO MAPPINGGO MAPPING分析分析PATHWAYPATHWAY分析分析中药组验证中药组验证（二）高温对猪空肠黏膜基因差异表达的影响第二十一页，共四十八页差异基因比较结果AffymetrixGeneChipPorcineGenomeArray含有含有23,937条探针代表已知猪的条探针代表已知猪的20,201个基因高温组与对照组比较（差异倍数高温组与对照组比较（差异倍数2.0）基因基因数量比例%表达基因1632171.6%不表达基因630327.6%表达上调930.41%表达下调1100.49%临界基因1860.8%第二十二页，共四十八页。

差异基因的聚类分析差异基因的聚类分析第二十三页，共四十八页差异基因列表差异基因列表探针号变化倍数基因库编号基因名称第二十四页，共四十八页荧光定量荧光定量PCRPCR验证验证变化趋势一致，芯片数据可靠变化趋势一致，芯片数据可靠第二十五页，共四十八页差异基因GO分类图 细胞过程细胞过程磷酸化过程磷酸化过程细胞成分细胞成分细胞细胞蛋白结合蛋白结合发育发育刺激反应刺激反应调节生物进程调节生物进程信号转导激活信号转导激活蛋白复合物蛋白复合物繁殖繁殖其它其它反应激活反应激活细胞器细胞器细胞器成分细胞器成分胞外区胞外区GO名名总数总数百分率百分率GO分类：细胞成分，生物进程，分子功能三大类分类：细胞成分，生物进程，分子功能三大类第二十六页，共四十八页差异基因分子功能分析差异基因分子功能分析第二十七页，共四十八页差异基因生物进程分析差异基因生物进程分析第二十八页，共四十八页细胞组分分析细胞组分分析第二十九页，共四十八页差异基因的差异基因的PathwayPathway分析分析第三十页，共四十八页 主要的生长因子主要的生长因子Epidermal growth factor (EGF)表皮生长因子表皮生长因子Bone morphogenetic proteins (BMPs)骨形成蛋白骨形成蛋白Erythropoietin (EPO)红细胞生成素红细胞生成素Fibroblast growth factor (FGF)成纤维细胞生长因子成纤维细胞生长因子Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF)粒系集落刺激因子粒系集落刺激因子Growth differentiation factor-9 (GDF9) 生长分化因子生长分化因子-9Hepatocyte growth factor (HGF)肝细胞生长因子肝细胞生长因子Insulin-like growth factor (IGF)胰岛素样生长因子胰岛素样生长因子Growth differentiation factor-15(GDF-15)生长分化因子生长分化因子-15Nerve growth factor (NGF)神经生长因子神经生长因子Platelet-derived growth factor (PDGF)血小板衍生。