《鼠单抗的改造》PPT课件.ppt

Medical Immunology1鼠单抗的改造Medical Immunology2本章主要内容本章主要内容概述C区的人源化-嵌合抗体V区的人源化-改型抗体小分子抗体Medical Immunology3概述鼠源性单抗在临床应用中存在的问题n具免疫原性 激发免疫应答，消弱疗效，产生副作用激发免疫应答，消弱疗效，产生副作用n与FC片段相关的功能不能有效活化 如活化补体，活化补体，ADCC,调理作用调理作用n半衰期短Medical Immunology4概述鼠源性单抗的改造原则n保持原来抗体的特异性与亲和力；保持原来抗体的特异性与亲和力；n尽量减小其免疫原性尽量减小其免疫原性发展阶段nC区的人源化-嵌合抗体 鼠抗鼠抗V区与人抗区与人抗C区组装而成区组装而成nV区的人源化 改型抗体改型抗体n小分子抗体Medical Immunology5C区的人源化-嵌合抗体 1984 Morrison首次报道首次报道依据 90%90%的人抗鼠抗体反应针对鼠抗的人抗鼠抗体反应针对鼠抗C C区区基本手段n从杂交瘤中获得鼠抗V区基因n从人B细胞获得人抗C区基因n将二者克隆到表达载体n转染哺乳动物细胞，进行表达Medical Immunology6C区的人源化-嵌合抗体主要形式n嵌合IgGn嵌合Fabn嵌合F(ab)2Medical Immunology7C区的人源化-嵌合抗体嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 如何构建？鼠抗基因鼠抗基因人抗基因人抗基因VLCLVHCH1CH2CH3VLCLVHCH1CH2CH3VHCH1CH2CH3VLCLMedical Immunology8C区的人源化-嵌合抗体嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgGn抗体基因的克隆w鼠抗V区基因的获得 RT-PCR方法方法 引物设计：依据引物设计：依据VH和和VL的组成的组成-由由4个相对个相对保守的保守的FR和和3个个CDR，设计（注意酶切位点）。

设计（注意酶切位点） Medical Immunology9C区的人源化-嵌合抗体嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgGn抗体基因的克隆w鼠抗V区基因的获得 提取提取mRNA：从杂交瘤或脾细胞中获得：从杂交瘤或脾细胞中获得 RT-PCR法克隆法克隆VH和和VL基因基因Medical Immunology10C区的人源化-嵌合抗体嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgGn抗体基因的克隆w人抗C区基因的获得 C C区的选择：区的选择：依据目的不同选择依据目的不同选择C区区即抗体即抗体亚型，如补体活化能力，亚型，如补体活化能力， ADCC等等 IgG1的补体活化及的补体活化及ADCC作用强于作用强于 IgG3，而而IgG4没有或很弱没有或很弱 与与Fc受体结合力受体结合力IgG1和和IgG3 最强最强 IgG1和和 IgG4半衰期较长半衰期较长Medical Immunology11C区的人源化-嵌合抗体嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgGn抗体基因的克隆w人抗C区基因的获得 引物设计：引物设计：C区基因，设计时注意酶切位点区基因，设计时注意酶切位点 提取提取mRNA：从：从B细胞中获得细胞中获得 RT-PCR法克隆法克隆C区基因区基因Medical Immunology12C区的人源化-嵌合抗体嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgGn表达载体的构建 构建嵌合构建嵌合L链与链与H链的重组质粒链的重组质粒 注意必须是真核表达载体注意必须是真核表达载体Medical Immunology13C区的人源化-嵌合抗体嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgGn嵌合抗体的表达 转染哺乳动物细胞进行表达转染哺乳动物细胞进行表达 哺乳动物细胞的选择：骨髓瘤细胞，哺乳动物细胞的选择：骨髓瘤细胞，COS细胞，细胞，CHO细胞等。

细胞等Medical Immunology14几种常用宿主细胞的表达特点COS细胞 短暂表达较为理想，几天内即可装配成功短暂表达较为理想，几天内即可装配成功骨髓瘤细胞 最主要的宿主细胞，如最主要的宿主细胞，如NS0CHO细胞 常用宿主细胞，常用宿主细胞，300-900mg/LMedical Immunology15n嵌合嵌合IgG优点与不足优点与不足优点优点保留了鼠抗的特异性与亲和力保留了鼠抗的特异性与亲和力基本解决鼠抗免疫原性所致的不良反应基本解决鼠抗免疫原性所致的不良反应能有效激活补体及能有效激活补体及ADCC延长半衰期延长半衰期改善药代动力学特性改善药代动力学特性Medical Immunology16 已批准上市的治疗性单抗已批准上市的治疗性单抗2001淋巴瘤淋巴瘤CD52人源化抗体人源化抗体Campath2000淋巴瘤淋巴瘤CD33人源化抗体人源化抗体Mylotarg1998RSV感染感染RSV F蛋白蛋白人源化抗体人源化抗体Synagis1998乳腺癌乳腺癌HER-2人源化抗体人源化抗体Herceptin19981999炎症性肠病类炎症性肠病类风湿关节炎风湿关节炎TNF-人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体Remicade1998移植排斥移植排斥CD25人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体Simulect1997淋巴瘤淋巴瘤CD20人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体Rituxan1997移植排斥移植排斥CD25人源化抗体人源化抗体Zenapax1994冠心病冠心病血小板血小板人人-鼠嵌合鼠嵌合FabReoPr o1995大肠癌大肠癌17-1A鼠单抗鼠单抗Panorex1986移植排斥移植排斥CD3鼠单抗鼠单抗OKT3批准日期批准日期适应症适应症靶向抗原靶向抗原抗体种类抗体种类抗体名称抗体名称Medical Immunology17嵌合嵌合IgG优点与不足优点与不足不足不足仍具一定抗原性仍具一定抗原性分子量较大，组织穿透能力较差分子量较大，组织穿透能力较差清除较慢清除较慢 在导向诊断与治疗方面受限在导向诊断与治疗方面受限Medical Immunology18C区的人源化-嵌合抗体Fab和F(ab)2嵌合抗体nFabw克隆鼠抗V区基因w克隆人抗CH1和C基因w重组w构建表达载体w转染宿主细胞，表达嵌合抗体Medical Immunology19Medical Immunology20C区的人源化-嵌合抗体Fab和F(ab)2嵌合抗体nF(ab)2w化学偶联法 通过化学试剂将Fab连接成一个双价抗体分子w重组末端修饰法 在Fab的C端额外连接一个Cys残基：效率较低 连接（CPP）3，效率可达70%Medical Immunology21C区的人源化-嵌合抗体Fab和F(ab)2嵌合抗体n优点w可原核表达 包涵体 ：高效，可达30%，复性难 分泌表达：周质腔，可溶有活性，避免降解，降低毒性 成功范例：抗CD3的Fab 700mg/L 人源化抗体HuMab4125-8 Fab 2g/LMedical Immunology22C区的人源化-嵌合抗体Fab和F(ab)2嵌合抗体n优点w可原核表达w良好的药物载体w血液清除率高w导向诊断与治疗Medical Immunology23C区的人源化-嵌合抗体Fab和F(ab)2嵌合抗体n缺点w无ADCC,CDCw滞留时间短w仍具一定抗原性Medical Immunology24V区的人源化 嵌合抗体不能完全解决抗原性问题 V区的人源化将鼠抗CDR移植到人抗V区中的FR区。

构建策略nCDR移植抗体 最为普遍最为普遍wCDR序列组成及构象分析,确定策略w人源FR模板的重构Medical Immunology25V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w移植策略完全CDR移植 将鼠抗全部6个CDR，克隆到人抗相应FR区上Medical Immunology26V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w移植策略部分CDR移植 外源性CDR仍具潜在抗原性 研究表明，轻链的CDR1,CDR2和重链CDR3是维持抗原结合所必需 将必需CDR移植到人抗FR上，得到人源化抗体Medical Immunology27V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w移植策略SDR转移 研究发现，CDR中的只有特定区域（SDR）参与了表位的识别和结合 SDR包括暴露在外与表位结合的残基，维持V区构象的残基 将SDR移植到人抗相应位置上，得到人源化抗体Medical Immunology28V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w人源FR模板的重构 原则：鼠CDR能正确折叠，保持原来构象 包括：从同源抗体或抗体共同序列中选择人源FR；根据已知信息，确定FR中起关键作用的氨基酸Medical Immunology29V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w人源FR模板的重构鼠源FR替换模板的选择 采用统一的人源FR作为替换模板：一般选择人抗最常见的VHIII和VI的框架区作替换模板。

好处：模板信息明确，避免盲目 不足：不易保持鼠抗CDR的天然构象，可能降低或丧失亲和力Medical Immunology30V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w人源FR模板的重构鼠源FR替换模板的选择 在抗体序列库中搜寻与鼠抗FR最大同源性的人源FR作为替换模板 好处：减少需要更改的氨基酸数目，更好保持CDR需要的空间环境Medical Immunology31V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w人源FR模板的重构人FR模板的残基变换 FR残基对表位结合也有影响 FR为CDR形成正确构象提供平台 因此，在替换时尽量保留与CDR有相互作用，或与抗体亲和力密切相关，或对FR空间结构起关键作用的残基Medical Immunology32V区的人源化构建策略nCDR移植的人源化抗体w人源FR模板的重构人FR模板的残基变换 如何确定这些残基？ 规范结构法、分子模拟，随即突变，序列分析，抗体库技术等，需晶体数据和三维结构分析数据Medical Immunology33V区的人源化构建策略n鼠抗V区的表面重塑 对鼠CDR及FR表面残基进行修饰或重塑，使其类似于人抗CDR轮廓或人FR式样。

w前提：鼠抗V区抗原性源于表面残基w研究表明，表面残基携带绝大部分表位表面形式的差异是人鼠抗体间的主要差别w将鼠源性残基替换成人源的，模拟人抗的表面轮廓，逃避人免疫攻击Medical Immunology34V区的人源化构建策略n鼠抗V区的表面重塑 对鼠CDR及FR表面残基进行修饰或重塑，使其类似于人抗CDR轮廓或人FR式样w好处：改变的残基少，可减少CDR与FR间的不相容性w正在完善之中w争论热点：鼠抗引起的人抗鼠抗体反应是由表面残基还是由内部残基引起？Medical Immunology35V区的人源化构建策略n表位导向的人源化抗体 利用表位导向选择进行鼠抗人源化要点：首先保留鼠抗H或L链； 特定抗原体外筛选它与人抗L或H链组合成的杂合抗体，找出维持其活性的人抗L或H链； 利用筛出的人抗L或H链，再筛出人抗H或L链，二者组合成完全人源抗体基础：建立完整的人抗体库 正在探索，前景广阔Medical Immunology36V区的人源化技术方案n鼠抗V区基因的获得nPCR法筛选阳性克隆n设计 鼠抗氨基酸序列分析：判断CDR区，特殊FR残基，糖基化位点，其它重要残基Medical Immunology37V区的人源化技术方案n设计 鼠抗氨基酸序列分析 鼠抗V区空间结构的模拟 人抗FR区序列的选择： 固定或同源匹配的固定或同源匹配的FR区区 L/H FR来源相同还是不同来源相同还是不同 选择人亚群一致还是特殊选择人亚群一致还是特殊FR 确定选择人确定选择人FR方案方案 抗体亚类的考虑抗体亚类的考虑Medical Immunology38V区的人源化技术方案n设计 鼠抗氨基酸序列分析 鼠抗V区空间结构的模拟 人抗FR区序列的选择 鉴别所选FR中公认的比较重要的回复突变 供体和受体序列分析 重新确认FR序列。