杜仲叶化学成分的研究.docx

杜仲叶化学成分的研究 [摘要] 杜仲叶来源于杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides的干燥叶为了深入了解杜仲叶中的活性成分，该研究采用D-101大孔树脂，MCI树脂，反相ODS，Sephadex LH-20，Rp-HPLC制备柱色谱法和重结晶等方法，从杜仲叶乙醇提取物的正丁醇萃取部位中分离得到10个化合物，通过MS和NMR等谱学方法，鉴定结构为山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷（1），槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（2），槲皮素（3），槲皮素-3-O-β-D-木糖基-（12）-β-D-葡萄糖苷（4），山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-（16）-β-D-葡萄糖苷（5），（2S，3S）-（-）-花旗松素-3-O-β-D-葡萄糖苷（6），4-羟基肉桂酸（7），（+）-环橄榄脂素（8），松脂素-β-D-葡萄糖苷（9），角鲨烯（10），其中化合物1，5～7，10为首次从该属植物中分离得到采用DPPH自由基清除法对分离得到的化合物进行抗氧化活性研究结果显示，其中化合物2表现出显著的自由基清除能力（IC50为13.7 μmolL-1），活性强于Vit C（IC50为59.9 μmolL-1）；化合物1，3，9显示中等强度自由基清除能力（IC50分别为161，137，214 μmolL-1），活性弱于Vit C，但强于2，6-二羟丁基对甲酚（IC50为236 μmolL-1）；化合物4，6自由基清除能力较弱（IC50分别为264，299 μmolL-1）；提示杜仲的药理作用，可能与其黄酮和木脂素类化学成分具有能够体内清除体内活性氧及抗氧化成分有关。

[关键词] 杜仲叶；化学成分；黄酮；木脂素；DPPH自由基清除法抗氧化活性 [收稿日期] 2013-11-27 [基金项目] 国家自然科学基金项目（81071037）；陕西省教育厅科技计划项目（09jk394） [通信作者] 宋小妹，Tel：（029）38185165，E-mail：； 梅其炳，Tel：（029）84779212，E-mail： 中药杜仲为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliver.的干燥树皮，味甘、性温，归肝、肾经，具有补肝肾、强筋骨等功效，主要用于肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕目眩等[1]本课题组前期研究中发现在去卵巢（OVX）大鼠骨质疏松模型上，杜仲提取物表现出较好的预防绝经后骨质疏松症的作用，与雌激素相比具有无子宫刺激的优点[2]，然而其抗骨质疏松作用的物质基础并不明确文献研究表明体内活性氧及抗氧化成分羟自由基SOD、MDA及GSH-Px等可能参与绝经后骨质疏松的病理过程[3-4]，由于杜仲富含黄酮、木脂素等多酚类化合物[5]，本研究推测杜仲抗骨质疏松作用可能是通过其能够影响活性氧及抗氧化成分有关。

因此，拟开展了杜仲化学成分的研究，并进行抗氧化活性测试，为揭示杜仲抗骨质疏松的药理作用奠定基础另外，由于杜仲的采集为15年以上植物的树皮，杜仲叶与杜仲皮具有相似化学成分和药理作用[6]，为了珍惜、保护及充分利用资源，本实验采用活性追踪的方式对杜仲叶化学成分进行了深入研究通过采用D-101大孔树脂、MCI树脂、反相ODS，Sephadex LH-20、Rp-HPLC制备柱色谱法和重结晶等方法，从中分离出10个化合物，并将分到的化合物通过1，1-二苯基-2-苄基苯肼自由基清除法（DPPH法）来评价其抗氧化活性 1 材料 Bruker-AVANCE 500核磁共振仪；Waters Quattro Premier型和Agilent Technologies 6550 Q-TOF质谱仪以及Agilent Technologies 6520 Accurate-Mass-Q-TOF LC-MS液质联用仪；Combiflash Rf 200快速制备色谱仪（Isco公司）；Waters 2695高效液相色谱仪，Shimadzu LC-6AD型高效半制备液相色谱仪（Ultimate XB-C18或Allsphere ODS-2制备柱）；Molgene 1810a型纯水仪；RV 10D digital FLEX型旋转蒸发仪（IKA公司）；DLSB-5/20型低温冷凝循环泵（郑州科工贸公司）；D-101大孔树脂（西安蓝晓科技新材料股份有限公司）；MCI-CHP-20树脂（日本三菱公司）；ODS-C18填料（加拿大SiliCycle 公司）、Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB公司）；柱色谱硅胶（100～200，200～300 目）均为青岛海洋化工厂产品，薄层硅胶为烟台江友硅胶发展有限公司生产；本实验所用试剂均为天津科密欧公司分析纯和色谱醇产品。

药材于2009年7月采自陕西省安康市石泉县，经陕西省药检所郭耀武教授鉴定为杜仲科植物杜仲E. ulmoide的叶，标本现存秦巴山区中药发展协同创新中心，标签为杜仲叶样本 2 提取与分离 杜仲湿叶18 kg恒温干燥（40 ℃）得干叶9 kg 95%乙醇回流提取3次，每次1.5 h将95%乙醇提取液减压浓缩至流浸膏，悬浮于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取取正丁醇层部分经D-101大孔树脂吸附，分别用水，20%，40%，60%，80%，95%的乙醇梯度洗脱，减压回收溶剂，分别得到20%乙醇洗脱部分（82.1 g），40%乙醇洗脱部分（73.9 g），60%乙醇洗脱部分（47.3 g），80%乙醇洗脱部分（34.5 g），95%乙醇洗脱部分（29.8 g）40%乙醇部分（73.9 g）经Flash制备色谱分离，甲醇-水洗脱（30∶70～100∶0）梯度洗脱，得Fr. I（5.7 g），Fr. II（15.3 g），Fr. III（23.9 g），Fr. IV（17.4 g），Fr. V（16.1 g）和Fr. VI（17.4 g），Fr. IV经反相ODS柱色谱分离，甲醇-水（10%～80%））梯度洗脱，收集13个亚组分（Fr. IV-1～Fr. IV-13），Fr. IV-10经Sephadex LH-20，反相HPLC制备纯化及重结晶等方法得到化合物1（173 mg），2（257 mg）；Fr. IV-11经反相ODS，Sephadex LH-20和反相HPLC制备纯化得到化合物3（13.1 mg），4（57 mg），5（52 mg），6（6.1 mg）；Fr. IV-5经反复Sephadex LH-20和重结晶得到化合物7（1.5 mg），8（3 mg），9（4.2 mg），10（18.7 mg）。

3 结构鉴定 化合物1 黄色晶体，紫外254 nm下有暗斑，10%硫酸乙醇显色呈棕黄色；盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应呈阳性1H-NMR（Me2CO-d6 ，500 MHz）δ：6.27（1H，d，J=2.1 Hz，H-6），6.52（1H，d，J=2.1 Hz，H-8），8.13（2H，d，J=8.75 Hz，H-2′，6′），6.97（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），5.25（1H，d，J=7.5 Hz，H-1″），3.32（3H，br s，4′-OCH3），3.65（1H，d，J=11.6 Hz，H-6b″），3.52（1H，d，J=5.2 Hz，H-6a″），3.12～3.51（4H，m，H-2″～5″）；13C-NMR（Me2CO-d6，125 MHz）δ：161.1（C-2），135.5（C-3），179.3（C-4），163.1（C-5），94.8（C-6），165.3（C-7），99.8（C-8），158.7（C-9），105.6（C-10），122.7（C-1′），132.3（C-2′），115.9（C-3′），158.1（C-4′），115.9（C-5′），132.3（C-6′），104.9（C-1″），75.3（C-2″），78.1（C-3″），71.3（C-4″），77.9（C-5″），62.9（C-6″），49.9（4′-OCH3）。

以上数据与文献[7]报道的山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷数据一致 化合物2 黄色晶体，紫外 254 nm下有暗斑，10%硫酸乙醇显色呈棕黄色；盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应呈阳性1H-NMR（MeOH-d4，500 MHz）δ：7.59（1H，d，J=2.2 Hz，H-2′），7.46（1H，dd，J=2.2，8.5 Hz，H-6′），6.74（1H，d，J=8.5 Hz，H-5′），6.06（1H，d，J=2.1 Hz，H-6），6.25（1H，d，J=2.1 Hz，H-8），5.12（1H，d，J=7.6 Hz，H-1″），3.60（1H，dd，J=2.3，11.9 Hz，H-6b″），3.45（1H，dd，J=5.3，11.9 Hz，H-6a″），3.11～3.65（4H，m，2″～5″）；13C-NMR（MeOH-d4，125 MHz）δ：158.7（C-2），135.3（C-3），179.1（C-4），162.7（C-5），94.3（C-6），165.6（C-7），99.5（C-8），158.1（C-9），105.3（C-10），122.8（C-1′），115.6（C-2′），145.5（C-3′），149.5（C-4′），117.2（C-5′），122.7（C-6′），103.9（C-1″），75.4（C-2″），78.0（C-3″），70.8（C-4″），77.7（C-5″），62.2（C-6″）。

以上数据与文献[8]报道槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的数据一致 化合物3 黄色粉末，紫外 254 nm下有暗斑，10%硫酸乙醇显色呈棕黄色；盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应呈阴性1H-NMR（MeOH-d4，500 MHz）δ：7.74（1H，s，H-2′），7.46（1H，d，J=8.2 Hz，H-6′），6.89（1H，d，J=8.2 Hz，H-5′），6.38（1H，s，H-8），6.18（1H，s，H-6）；13C-NMR（MeOH-d4，125 MHz）δ：149.0（C-2），137.5（C-3），177.6（C-4），162.7（C-5），94.7（C-6），166.0（C-7），99.6（C-8），158.5（C-9），104.7（C-10），124.4（C-1′），116.2（C-2′），146.5（C-3′），148.2（C-4′），116.5（C-5′），121.9（C-6′）以上数据与文献[9]报道槲皮素的数据一致 化合物4 黄色粉末，紫外 254 nm下有暗斑，10%硫酸乙醇显色呈棕黄色；盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应呈阳性。

1H-NMR（MeOH-d4，500 MHz）δ：7.64（1H，s，H-2′），7.63（1H，d，J=8.2，2.1 Hz，H-6′），6.88（1H，d，J=8.2 Hz，H-5′），6.38（1H，s，H-8），6.19（1H，s，H-6），5.35（1H，d，J=7.6 Hz，H-1″），4.79（1H，d，J=8.1 Hz，H-1），3.95（1H，dd，J=4.9，11.6 Hz，H-6b″），3.75（1H，dt，J =8.8 Hz，H-2″），3.72（1H，dd，J =2.3，11.6 Hz，H-6a″），3.20～3.63（8H，m，H-3″～5″，2～4，5a，5b）；13C-NMR（MeOH-d4，125 MHz）δ：158.8（C-2），135.4（C-3），179.8（C-4），163.2（C-5），100.3（C-6），166.8（C-7），95.0（C-8），158.7（C-9），105.8（C-10），123.。