引物篇引物合成与各种问题总结.docx

精品名师归纳总结引物篇1 .引物是如何合成的？目前引物合成基本采纳固相亚磷酰胺三酯法 DNA 合成仪有许多种,主要都是由 ABI/PE 公司生产, 无论采纳什么机器合成, 合成的原理都相同, 主要差别在于合成产率的高低, 试 剂消耗量的不同和单个循环用时的多少亚磷酰胺三酯法合成 DNA 片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳固的特点 亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定在固相栽体上完成 DNA 链的合成的,合成的方向是由待合 成引物的 3 端向 S 端合成的,相邻的核昔酸通过磷酸二酯键连接第一步是将预先连接在固相栽体 CPG 上的活性基团被爱护的核昔酸与三氯乙酸反应,脱去 其S- 軽基的爱护基团 DMT, 获得游离的軽基其次步,合成 DNA 的原料,亚磷酰胺爱护核昔酸单体,与活化剂四氮瞠混合,得到核昔亚 磷酸活化中间体,它的 3 端被活化, 5 、轻基仍旧被 DMT 爱护,与溶液中游离的 5 二轻基发 生缩合反应第三步,带帽（ capping ）反应,缩合反应中可能有极少数 3 氓基没有参与反应（少于 2% ）,用乙酸酹和 1- 甲基咪哇终止其后连续发生反应,这种短片段可以在纯化时分别掉。

第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷醸形式转变为更稳固的磷酸三酯经过以上四个步骤,一个脱氧核昔酸被连接到固相栽体的核昔酸上再以三氯乙酸脱去它的 S- 務基上的爱护基团 DMT, 重复以上步骤,直到全部要求合成的碱基被接上去合成过程 中可以观寮 TCA 处理阶段的颜色判定合成效率通过氨水高温处理,连接在 CPG 上的引物被切下来,通过 OPC, PAGE 等手段纯化引物, 成品引物用 C18 浓缩, 脱盐,沉淀沉淀后的引物用水悬浮,测定 OD260 定量,依据定单 要求分装2 .引物纯化方式有哪些,如何挑选？. C18 柱脱盐： 有人称其为简易反相柱, 它对 DNA 有特异性的吸附, 可以被有机溶解洗 脱, 但不矣被水洗脱, 所以能有效的去除盐分 它不能有效去除比目的片段短的小片段 实 际上, 它是一种脱盐的作用这种方法一般不矣对一般 PCR 反应产生影响对于需要用干 测序、克隆的引物不能使用这个级别 OPC 纯化： OPC 纯化是依据 DNA 爱护基（ DMTr 基）和 Cartridge 柱中树脂间的 亲合力作用的原理进行纯化目的 DNA 片段。

OPC 法纯化的 DNA 纯度大于 95% 适用干 40mer 以下引物的纯化 PAGE 纯：PAGE 纯化法是便用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 对 DNA 片段进行分别, 然 后从凝胶中回收目的 DNA 的方法 PAGE 纯化法也是一种特别有效的 DNA 纯化方法,纯 化后的DNA 纯度大于 95%, 对长链 Oligo DNA （大于 50mer ）的纯化特殊有效 HPLC 纯化： HPLC 纯化是使用高效液相色谱的原理,对 DNA 片段进行纯化纯度可 以大于 99% O 主要用干短链和修饰引物的纯化该法的弱点是成本较高,批量生产效率不 高3 .引物的 OD 数如何定量？答：引物合成引物 OD 数是这样测定的：用紫外分光光度计,波长 260nm, 石英比色杯, 光程为 1 厘米,测定溶液的光密度测定时溶液的光密度最好稀释到 0.2-1.0 之间 DNA 干粉用肯定体积的水充分振荡溶解以后,用 lml 水稀释测 OD 值需要依据稀释倍数换算 出母液的 OD可编辑资料 -- -- -- 欢迎下载精品名师归纳总结值4 .需要什么级别的引物？答：引物常用的纯化方式 C18 脱盐, OPC 纯化, PAGE 纯化, HPLC 纯化。

依据试验需要 ,确定订购引物的纯度级别应用引物长度要求纯度级别要求一般 PCR 扩增 < 45base OPC>45 base PAGE诊断 PCR 扩增 < 40base OPC, PAGE DNA 测序 20base 左右 OPC亚克隆,点突变等依据试验要求定 OPC, PAGE, HPLC基因构建（全基因合成） 依据试验要求定 PAGE反义核酸依据试验要求定 PAGE修饰引物依据试验要求定 PAGE, HPLC5 .最长可以合成多长的引物？答：引物越长,显现问题的概率就越大我们合成过 120base 的引物,但是产率很低除 非需要,建议合成片段长度不要超过 80mer, 依据目前的引物合成效率,SOmer 的粗产品,全长（仍不肯定正确）引物的百分比不矣超过 40%, 后续处理仍有丢失 许多,最终的产量是很低6 .需要合成多少 OD 数？答：依据试验目的确定一般 PCR 扩增, 2OD 引物,可以做 200-500 次 50ul 标准 PCR 反应假如是做基因拼接或退火后做连接, 1OD 就足够了但是有些讨论人员,就做几次 PCR, 但是却要 5-10 ODo 做全基因构建的引物都比较长,但是我们有些讨论人员也要求 高 OD 数。

片段越长,最终全长得率就越低,出错的几率就越大超出需要之外的 OD 数要 求,其实也是对社矣资源的一种铺张,同时也从一个侧面反映了部分讨论人员,特殊是新手 的自信心不足, 总觉得需要重复多次才能胜利7 .如何检测引物的纯度？答：试验室便利的作法是用 PAGE 方法使用加有 7M 尿素的 16% 的聚丙烯酰胺凝胶进行 电泳取 0.2-0.50D 的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上 样前加热变性（ 95°C,2mins ）加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,简洁加样 600V 电压进行电泳,肯定时间后（约 2-3 小时）,剥胶,用荧光 TLC 板在紫外灯下检测带型 , 在主带之下没有杂带,说明纯度是好的假如条件许可,也可以用 EB 染色或银染方式染 色8 .如何运算引物的浓度？答：引物储存在高浓度的状况下比较稳固弓 I 物一般配制成 10-50pmol/ul o 溶解前您需 要核对合成报告单和引物标签上的引物 OD 数是否一样假如不一样,请和我们联系我 们可以依据生产记录查到实际产量是多少一般情形下,我们建议将引物的浓度配制成 50pmol/ul, 加水的体积（微升）按以下方式 运算： V （微升） =OD 数* （乘） 33* （乘） * （乘） 20000/ （除）引物的分子量。

引物的分可编辑资料 -- -- -- 欢迎下载精品名师归纳总结子量可以从合成报告单上获得假如需要配制成其他浓度,按上述公式换算可编辑资料 -- -- -- 欢迎下载精品名师归纳总结留意： 1 OD260= 33 ug/ml . 9 .如何运算引物的 Tm 值？答：引物设计软件都可以给出 Tm, 引物长度,碱基组成,引物使用缓冲的离于强度有关 长度为 25mer 以下的引物, Tm 运算公式为： Tm = 49〔G + C〕+2 °C〔A + T〕 对干更长的塞聚核昔酸, Tm 运算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x LoglO[Na+] + 0.41 〔%GC〕 - 600/size 公式中, Size= 引物长度Tm 的定义： Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to让 s complementary strand . In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence liasa liiglier melting temperature. The strand concentration: higli oligonucleotideconcentrations favor liybrid formation, which results in a higlier melting temperature. The salt concentration: higii ionic strength results in a higlier Tm as cations stabilize the DNA duplexes .10 .引物〔 含修饰 〕 的分于量是如何确定的？答：非修饰的引物的 Molecular Weiglit 在随引物供应的报告单上都有明确的标示。

假如需 要估量一个引物的分于量按每个碱基的平均分于量为 324.5, 引物的分于量 =碱基数 x 碱 基的平均分子量或按以下公式运算 MW= 〔NA * WA〕 + 〔NC * WC〕 + 〔NG * WG〕 + 〔NT * WT〕 +〔Nmod* Wmocl〕 + 〔Nx * Wx〕 +〔 Ni* Wi〕 +16* Ns - 62.NA, NG, NC, NT, Ni 分别为引物中碱基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的数量, WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的分于量, Nmod, Wmod 分别为修饰基团的 数目和分子量「对于混合碱基的分于量为混合碱基的分子量总合除以混合数,例如 G+A 混合的分于量为〔313.21+329.21〕 /2 = 321.21 Ns 为硫代数目,硫代每个位直增加分子量 16 常规碱基分于量Base Molecular Weiglit A 313.21C 289.18G 329.21T 304.19I 314.2U 290.17可编辑资料 -- -- -- 欢迎下载精品名师归纳总结常规修饰基团分子量5' - Biotin 405.45 35' - 〔6 FAM〕 537.46 3-T’AMARA 623.60-’Dabsyl 498.49可编辑资料 -- -- -- 欢迎下载精品名师归纳总结5' -HEX5, -TET5' -Cy55' -Cy3744.13675.24533.63507.593' -〔6 FAM〕 569.46 3' -Amino Modifier C3 3' - Amino Modifier C73 , -Thiol Modifier C3153.07209.18154.12可编辑资料 -- -- -- 欢迎下载精品名师归纳总结11 .如何溶解引物？答：干燥后的引物质的特别疏松,开盖前最好离心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,将引 物粉末收集到管底。

依据运算出的体积加入去离子无菌水或 10mM Tris pH7.5 缓冲液, 室温放直几分钟,振荡助溶,离心将溶液收集到管底溶解引物用的水一般不要用蒸他水, 由于有些可编辑资料 -- -- -- 欢迎下载精品名师归纳总结蒸憎水的 pH 值比较低 〔pH4-5〕 ,引物在这种条件下不稳固12 .如何储存引物？答：引物合成后,经过一系。