昆虫病原体的采集整理和症状识别.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑昆虫病原体的采集整理和症状识别 测验一、昆虫病原体的采集、整理和病症识别 一、目的要求： 昆虫病原体的采集，整理是研究昆虫病理和利用微生物举行害虫防治的第一步识别病症是诊断学的主要内容本测验要求对昆虫疾病有一个较直观的了解，从而为今后工作打下根基 二、测验内容： 1． 病体材料的收集 因病死亡的昆虫，可察觉于植物的枝叶、茎内、花苞果实中地表土下等，样本多数脆弱因此，采集时应以单个样本连同基物的一部份或全部置于小瓶中，并加棉塞 已收集到的病、死虫体，应急速处理，举行检查，鉴定和分开病原，并没有举行寄主病情的描述，举行编号和记载，也要考虑到病理组织学的研究和回接试验所用因此，要有确定的标本数量同时，有必要对采到的材料举行暂时保存冷藏可进一步阻拦样本进一步腐解，可将病虫死体置于冰箱保存 2． 样本的病症识别： （1） 细菌病的一般特征：感病昆虫活动力减退，食欲减退，食量大减，口腔、 肛门常有吐泻排泻物，多数因败血症而死亡死虫躺卧在植物或其他物质外观，或侧挂于枝叶体色多加深至黑色或红色内部组织崩溃粘液态，有时发臭。

（2） 真菌病的一般特征：死虫笔直僵硬，体表多笼罩有菌丝或孢子，呈现白色、 黄色、红色、褐色或绿色、黑色等体脆，受压易碎裂 （3） 病毒病的一般特征：类似于细菌，但无上吐下泻现象死虫常倒挂或平卧 于植物上虫体柔嫩，表皮一触即破内部组织液化 3． 查看以下标本： （1） 细菌病：菜青虫、小菜蛾、柑桔凤蝶 （2） 真菌病：虫霉：桃蚜、蝉、蝇 冬虫夏草 白僵：松毛、象虫、稻纵卷时螟、瓢虫 绿僵：菜青虫 菜氏蛾霉：柑桔粉虱 轮枝：蚜虫 青霉：荔枝 拟青霉：柑桔卷叶蛾 （3） 病毒病：NPV：8305、棉铃虫、松毛虫舞毒蛾 GV：菜青虫、小菜蛾、东方粉蛾 （4） 线虫：DD—136 测验二、昆虫病原细菌、真菌的分开及病毒的提纯 三、目的要求： 为了获得昆虫病原微生物，为鉴定、分类等到的研究和生产应用，首先就必需对罹病昆虫举行分开筛选，对它们的杀虫才能和其他特性举行对比鉴定结果选出毒力高、性能优良的品系供防治害虫用 四、测验材料： 解剖皿 75%酒精 剪刀 0-1%升汞 镊子 无菌水 接种环 磷酸缓冲液（PBS） 培养皿 天平 离心机 滤纸 五、测验内容： 1． 病原细菌的分开：把罹病昆虫放入75%酒精中浸泡0.5分钟然后放在0.1%升汞 中消毒0.5～１分钟，再以灭菌洗３次。

外观消毒后放入解剖皿，解剖皿的外观石蜡须以75％酒精洗擦消毒，并擦过火焰虫体从后面或腹面举行纵向解剖全体器械事先均须消毒留神不能使肠壁破碎血液可体液取出，用无菌水稀释，每培养皿装入2ml左右无菌水，共用３个培养皿，从第１皿中用接种环移入３环至第２皿， 再从第２皿移入３环至第３皿，结果倒入冷却至40-50C的细菌培养基，放入３０C温箱培养一天后举行菌落查看，并用划线阖举行纯化纯化后的细菌转入斜面培养并置于冰箱保存 2． 病原真菌的分开：被真菌侵染的虫体，可以用灭菌的镊子，或接种针，直接从 体表挑取菌丝或孢子而移接于适合的真菌培养革上培养应同时举行体表和内部真 菌的分开，检验是否为同一菌种在25C左右培养由于真菌一般比细菌生长慢，有时为了操纵细菌污染，可在培养基中参与少量的抗菌素 3． 昆虫病毒的提纯：病毒、立克次氏体，原生动物和多数线虫不像真菌和细菌那 样奶在人工培养基上培养针对昆虫病毒，主要是举行提纯，以供鉴定，分类等研究之用 （1） 低速差异离心法：将病虫称重后捣碎，以1:40比例，即1克虫体加40ml 磷酸缓冲液（PBS），过滤去渣，滤液以500转/分开心15分钟，除去组织碎片杂质（沉渣），上清液再以4000转/分开心2小时，弃去上清液，取沉淀。

如此可反复几次用滤纸吸干再冰冻枯燥 （2） 丙酮一乳糖共沉法：怪病虫称重后捣碎，以1:40PBS稀释，尼龙纱过滤， 滤液经1500~2000转/分开心2小时，弃上清液，按1:10加5%乳糖溶液，充分搅拌后，缓缓参与4倍量丙酮，边加边搅拌30分钟，静置10分钟，3500转/分开心20分钟将沉淀物缓缓参与适量丙酮，边加边搅拌30分钟，再离心，如此重复3次即可得到灰白色粉状病毒，经冷却枯燥，称重，于冰箱中保存 此外，还有蔗糖梯度分开法和分子筛胶层析法 测验三、昆虫病原微生物——细菌染色技术及形态查看 一、目的要求： 昆虫病原微生物的鉴定是昆虫病理学研究的重要范畴，是微生物防治害虫中不成疏忽的步骤对昆虫传染病的熟悉和致病理由确实定均取决于对病原微生物的正确鉴定，而且直接关系到病原体的生产、剂型和使用 本测验要求通过显微镜检查和细菌学上的几个鉴别染色法来学习掌管鉴定细菌的 常规方法，达成提高识别细菌形态的才能，和掌管鉴定细菌的技能 二、测验仪器： 玻片、酒精灯、接种环、香柏油、擦镜纸、二甲苯、显微镜、火柴、洗液瓶、镊子 供鉴定菌株：8010、7216、HD-1、140、009、021、E-3、016、023、087、010、096、012、013、B-Hm18、8311。

三、测验内容： 1． 格兰氏染色： 溶液A：溶解4克结晶紫（包含90%）于40ml的95%乙醇中 溶液B：溶解1.6 克草酸铵于160ml蒸馏水中 混合A、B液，用前混合液要放置48小时 路哥氏液：先溶解2克碘化钾于5ml的蒸馏水内后加碘1克使溶解，再加295ml蒸馏水 复染剂：加2.5%的藏红乙醇（95%）溶液20ml于200ml的蒸馏水中 步骤：涂片火焰枯燥，后用草酸铵结晶紫染1分钟，水冲洗5秒，然后用路哥氏碘液冲洗1分钟，水洗5秒，湿片用正丙醇换浸3次，每次1分钟，水冲洗5秒也可用95%乙醇处理0.5分钟1次，以代替正丙醇藏红复染液冲洗1分钟，结果水冲洗1分钟，凉干镜检 结果格兰氏阳性菌染成紫色，格兰氏阴性菌染成红色留神好多细菌对格兰氏回响常有京华，更加是较老的菌种最好是用培养8~16小时的菌种，一般不超过24小时此测验的染料配方好多，但告成与否，主要抉择于阅历应同时在同一玻片上设有阴阳对照 经典的染色法是丹麦，医生草革兰氏所研发，他在1884年报告了这个方法是作为在组织切片中使细菌着色的步骤该法已沿用了100年最近，美国加州大学和贵州农学院植保系都分别找到了一种极为简便，结果切实稳当的方法。

该法是在明净的载玻片上滴上一滴3%的NaOH或KOH,用火柴杆或牙签挑取PDA平板上培养24~48小时的待测干菌干滴液里，急速用火柴棍将菌与滴液调匀，边调边将火柴棍用上抬起凡G-在液滴中均变笛，并在火柴棍离开玻片时形成粘稠丝而G-无论用多大菌量与1滴NaOH溶液混合均不增加粘性，更不会形成粘稠丝该方法对老菌株和新菌株均有效，但使用老菌株时量要用得多一点值得留神的是NaOH+相当于G++，NaOH-相当于G+ 2、 芽孢染色： 此法适用于区分细菌的芽孢和养分细胞涂片自然枯燥，火焰固定后，以5%孔雀绿水液浸染并蒸热10分钟，蒸时可将玻片置于酒精灯火焰上徐徐加热至染色剂溶液开头冒气但不煮沸腾，加热时可随时加注数滴染色剂于载玻片上，以免染剂蒸干，后来水冲洗30秒，用番红复染15秒水冲洗30秒凉干镜检，结果芽孢染成绿色，养分细胞为红色 3、 晶体染色：涂片火焰枯燥，用苯酚品红染1分钟，水洗，凉干镜检，结果晶体染成 紫色，芽孢为通明椭圆形，仅见具有轮廓的折光体 查看苏云金杆菌不同变种的晶体外形大小 4、 鞭毛染色： 染液配方好多，有赖夫生染色法、银盐染色法，西萨——基尔染色法等。

一般以西萨——基尔（Cesares-Gill）染法效果最正确 媒染剂：单宁10克 Alcl3 6H2o 1.8克 Zncl210克 碱性品红花 1.5克 酒精（40%）40ml 研钵中盛酒精10ml,加上以上各种成分充分研磨混合后，再参与多余的酒精，使用前用蒸馏水稀释2倍染色时过滤，滤液直接滴在涂片上 染液：碱性品红花 0.3克 苯酚 5克 酒精（95%） 10ml 蒸馏水 95ml 溶液Ⅰ和溶液Ⅱ分别配制后混合 步骤：斜面培养10~12小时的苏云金杆菌试管中参与无菌水，半个小时后，用接种环在清白玻片上点上9环，自然凉干，用媒染剂染5~7分钟，轻轻用水冲洗苯酚品红染色5分钟后水洗，凉干待检 留神：鞭毛染色时涂片不能用火焰固定，否那么受热后鞭毛蛋白变性，鞭毛收缩，无法看到 测验四、昆虫病原真菌的染色及形态查看 一、目的要求： 昆虫病原微生物——真菌病害的鉴定主要是根据病症和病原真菌的形态，因此要确定其是否是致病真菌，其鉴定应以病原真菌的形态为依据。

鉴定真菌的方法主要是显微镜检查 本测验学习鉴定真菌的常规方法，提高识别昆虫病原真菌的才能要求查看菌丝体和其他养分繁殖体的形态和布局，孢子形态和着生方式，子实体的形态布局和产生的部位 二、测验器材： 解剖针、棉兰、玻片、盖玻片、乳酚油、显微镜、刀片 三、方法和步骤： 标本或培养基上的菌丝体或子实体，一般是直接用针挑取少许，放在加有一滴浮载剂的载玻片上，加盖玻片在显微镜下检视对一些真菌如坚实的子实体那么需采用徒手切片检视 浮载剂：水、乳酚油 染料：乳酚油中可加适当的染料染色，最常用的染料是苯铵兰（棉兰）用量是0.05~0.1%. 四、镜检标本： 1． 虫霉 01、02、03、04、05、8101、8111、8112、叶蝉虫霉、稻飞 （豆芽）（飞虱）（飞虱） 虱虫霉（福州），飞虱虫霉（沙县）、蝗霉、（飞虱）蝇霉 查看虫霉菌的分生孢子，次生分生孢子，接合孢子，菌丝段 2． 冬虫夏草 查看子座、子囊壳、子囊、子囊孢子 3． 白僵菌 查看菌丝，分生孢子形态 4． 绿僵菌 查看菌丝，分生孢子形态 5． 多毛菌 查看菌丝，分生孢子梗在菌丝上的生长特点，分生孢子形态。

6． 菜氏蛾霉 查看菌丝，分生孢子梗、分生孢形态 7． 赤座霉 查看子座颜色，分生孢子器。