常用实验方法和所需试剂的配制.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑常用实验方法和所需试剂的配制 （一）Western-blot测验 1. Western blot主要测验试剂 溴酚蓝（Bromphenol Blue） 丽春红（Ponceau S） 考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue R-250） 吐温-20（Tween-20） β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol) 十二烷基硫酸钠（SDS ） 过硫酸铵（APS） TEMED 聚丙烯酰胺凝胶单体贮备溶液 4×浓缩胶缓冲液 4×浓缩胶缓冲液 甘氨酸 Tris碱 脱脂奶粉 牛血清白蛋白（BSA） 硝酸纤维素膜（NC膜） 蛋白质Marker和预染 Marker 通用蛋白裂解/提取试剂 BCA法蛋白定量试剂盒 Bradford法蛋白定量试剂盒 兔源性抗抗体 辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG ECL超敏发光液 定影液、显影液、X光胶片曝光盒 其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等） 2. Western-blot主要测验试剂的配制方法 （1）10%SDS溶液: SDS粉末1g,加双蒸水10mL使其溶解，室温保存。

（2）10%APS：APS 20mg,加双蒸水200μL,混匀，现配现用 （3）10×电极缓冲液（PH8.3）: SDS粉末10g、Tris碱30.4g、甘氨酸144g，双蒸水定溶至1000mL，4℃保存，用时10倍稀释 （4）考马斯亮蓝固定液：乙醇500mL、冰醋酸10mL、双蒸水定溶至1000mL （5）考马斯亮蓝脱色溶液：95%乙醇250mL、冰醋酸80mL，双蒸水定溶至1000mL （6）考马斯亮蓝染色溶液：0.29g考马斯亮蓝,溶解于250mL脱色液中，过滤后室温保存 （7）转移缓冲液：甘氨酸2.93g、Tris碱5.812g、甲醇200mL、去离子水定溶至1000mL，4℃保存 （8）10×TBS溶液：Nacl87.75g、Tris碱12.1g，用双蒸水溶至1000mL，4℃保存，用时10倍稀释 （9）TBST溶液： 1×TBS溶液1000mL、Tween-20溶液1mL，混匀 （9）丽春红溶液：100g丽春红,5mL冰醋酸，双蒸水定溶至100mL，室温保存 （11）5×上样缓冲液：1mol/LTris-HCl(pH6.8) 0.6mL、甘油2.5mL、10% SDS溶液2mL、β-巯基乙醇（使用前加）0.5mL、1%溴酚蓝溶液1mL，去离子水定溶至10mL，4℃保存。

（12）12%分开胶：聚丙烯酰胺单体贮备液3.2mL、4×分开胶缓冲液0.5mL、10%SDS溶液80μL、10%APS溶液25μL、TEMED原液10μL、双蒸水溶至8mL （13）5%浓缩胶：聚丙烯酰胺单体贮备液0.68mL、4×浓缩胶贮备液0.25mL、10%SDS溶液40μL、10%APS溶液15μL、TEMED原液5μL、双蒸水溶至4mL （14）NC膜封闭液：脱脂奶粉1g，TBST溶液20mL中溶解，4℃保存 （15）抗体稀释液：TBST溶液20mL、小牛血清白蛋白1g，混匀，4℃保存 （16）Striping Buffer：β-巯基乙醇 35μL、10%SDS 溶液1mL、0.5MTris溶液(pH6.7) 625μL，去离子水定溶至5mL，室温保存 3. Western-blot测验步骤 （1）总蛋白的提取 （采用北京普利莱公司蛋白质抽提试剂盒抽提） ①电子天平精确称取组织50mg（±2mg），放入含有1mL细胞裂解液和适量的PMSF（终浓度为1mmoL/mL）的预冷玻璃匀浆器内，冰上匀浆 ②取0.5mL匀浆液移入新的2mLEP管内，加1mL蛋白抽提试剂并混匀，静置 10min后（偶有颠倒混匀），12000g 4℃离心10min。

③弃去上清留存蛋白质膜，加2%SDS溶液500μL，100℃水浴10min，4℃放置2小时使蛋白质膜充分溶解 （2）总蛋白浓度的测定（BCA法） ①配制统一的蛋白质标准品：以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的标准品溶液（浓度为1mg/mL）制作蛋白质标准曲线分别吸取BSA标准品溶液0、100、200、400、800、1200、1600和2000μL，各自参与0.01MPBS溶液补足到2000μL，配成梯度浓度的标准品溶液，分装后-20℃备用 ②配制BCA工作液：按50：1的比例将BCA试剂盒内的A试剂与B试剂举行混合，配成BCA工作液室温保存，1d内使用 ③样品处理：取各样品10μL，加0.01MPBS溶液490μL，配成待测样品 ④加样：先于酶标板上样孔内参与200μL BCA工作液，再分别参与倍比稀释的标准品及待测样品各20μL，酶标仪上震荡3min，充分混匀 ⑤测定：将酶标板置于恒温水浴箱中，37℃孵育30min用MRK3型酶标仪测定562nm波长下各孔吸光度值（optical density，OD），采用Softmax5.2软件计算各样本蛋白质浓度。

（3）样品浓度的配平和制备 ①配平：按测定的各样品蛋白质浓度，用2%SDS溶液配平各样品总蛋白浓度根据预测验结果，将组织的总蛋白浓度调为1mg/mL ②制备：将配平后的样品与5×上样缓冲液按4：1的比例混合 100℃水浴10min，片面4℃保存用于电泳，片面-20℃保存备用 （4）样品内蛋白含量的检测 ①凝胶的配制：配制12%分开胶和5%浓缩胶（配制方法见附录） ②上样：分别用Eppendorf微量移液器吸取蛋白质Marker或样品各10μL，将枪尖的插入加样孔的底部，缓慢地将样品或Marker参与加样孔，制止有气泡产生 ③电泳：浓缩胶：电压100V、电流400mA，电泳20min；分开胶：120V，400mA，电泳50min，待溴酚蓝到达凝胶底部，关闭电源 ④蛋白质转膜：恒压转移，转膜参数：电压100V，电流350mA，转移23min终止后，将硝酸纤维素膜（nitrocellulose，NC膜）于丽春红染液中染色10 min，可 见明显的红色条带，说明转膜告成去离子水冲洗，根据蛋白质Marker的位置将含有目的蛋白的膜条带上下各0.5cm）裁下。

⑤封闭：把NC膜置于封闭液内室温封闭4h（摇床上举行），TBST液洗膜2min×3次 ⑥免疫回响：将封闭好的膜置于一抗溶液中4℃孵育过夜，TBST溶液洗3min×5次后，NC膜再于辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG溶液中孵4℃育1h，用TBST溶液洗膜3min×5次以上步骤均在摇床上举行 ⑦曝光：将ECL超敏发光液中的A液和B液按1：1比例混合后滴于NC膜上，暗室内曝光30s，X-光片在显影液中显影2min，定影液中定影5min ⑧分析结果：将NC膜上肌动蛋白染色条带结果扫描后输入电脑，IPP5.0图像分析系统分析结果 （二）免疫组化（荧光）染色测验 1. 免疫组化（荧光）染色主要测验试剂 防脱片剂 一抗抗体 免疫组化试剂盒（SP或SABC） DAB试剂盒 罗丹明标记的羊抗兔IgG 组织自身荧光淬灭剂 其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）均为国产分析纯 2. 常用试剂的配制 （1）0.01MPBS溶液：中衫公司的PBS粉末一包，加蒸馏水2000mL，混匀，室温保存。

（2）4%多聚甲醛溶液：500ml 0.01MPBS液加40g多聚甲醛在2000 ml的烧杯内加热至60℃，边搅拌边加热，至溶液呈澄清，另加500 ml 0.01MPBS液至1000 ml冷却后过滤， 4℃冰箱保存备用 （3）苏木素： （4）伊红： 3. HE染色方法 （1）二甲苯I脱蜡10min （2）二甲苯II、III脱蜡各5min （3）无水乙醇洗1min×2次 （4）95％酒精1min （5）90％酒精1min （6）85％酒精1min （7）自来水洗2min （8）苏木素染色1～5min （9）自来水洗1min （10）1％盐酸酒精分化20s （11）自来水洗1min （12）稀氨水（1％）反蓝30s （13）自来水洗或蒸馏水洗1min （14）伊红染色20s～5min （15）自来水洗30s （16）85％酒精脱水20s （17）90％酒精30s （18）95％酒精1min （19）95％酒精1min （20）无水乙醇2min （21）无水乙醇2min （22）二甲苯I、II、III通明各5min （23）中性树胶封片 4.免疫组化染色 (1)制作切片：组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE染色步骤举行； (2)抗原修复：0.01M的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min，冷却至室温后，PBS溶液洗3min×3次； (3)封闭：封闭液室温封闭30min，弃去封闭液，不洗； (4)免疫回响：滴加一抗抗体，4℃孵育过夜（保湿盒内举行），PBS溶液洗切片 — 7 —。