动物细胞培养制药工艺.pdf

4.1 制药动物细胞4.1 制药动物细胞 4.2 动物细胞的生产特征4.2 动物细胞的生产特征 4.3 动物细胞培养基制备4.3 动物细胞培养基制备 4.4 动物细胞培养技术4.4 动物细胞培养技术 4.5 重组人红细胞生成素的生产工艺4.5 重组人红细胞生成素的生产工艺第四章 动物细胞培养制药工艺第四章 动物细胞培养制药工艺?动物细胞的结构与功能动物细胞的结构与功能?制药动物细胞的种类制药动物细胞的种类?生产用细胞系生产用细胞系4.1 4.1 4.1 4.1 制药动物细胞制药动物细胞制药动物细胞制药动物细胞细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系1. 形态特征形态特征?细胞膜细胞膜?细胞质细胞质?细胞核细胞核?没有细胞壁没有细胞壁?亚细胞器亚细胞器4.1.1 4.1.1 4.1.1 4.1.1 动物细胞的结构与功能动物细胞的结构与功能动物细胞的结构与功能动物细胞的结构与功能细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系2 2、、、、动物细胞培养的代谢特征动物细胞培养的代谢特征动物细胞培养的代谢特征动物细胞培养的代谢特征葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代谢的前体。

葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代谢的前体 葡萄糖限制葡萄糖限制: :通过增加谷氨酰氨消耗得以补偿，反之通过增加谷氨酰氨消耗得以补偿，反之 亦然 葡萄糖代谢：糖酵解为主葡萄糖代谢：糖酵解为主，，生成丙酮酸和乳酸，乳酸生成丙酮酸和乳酸，乳酸 分泌到胞外并在培养液中积累另一条途径为分泌到胞外并在培养液中积累另一条途径为TCATCA循循 环，彻底氧化产生环，彻底氧化产生COCO2 2和水一小部分为戊糖磷酸途和水一小部分为戊糖磷酸途 径径，，生成生成4 4、、5 5、、7 7碳糖和碳糖和NADPHNADPH中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢 葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，对细胞有毒性葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，对细胞有毒性细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系GlnGln代谢：脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需代谢：脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需 氨基酸 GlnGln氮源，氮源，GlnGln受限，增加其他氨基酸消耗以补偿受限，增加其他氨基酸消耗以补偿 离体动物细胞系，转氨作用是主要代谢途径谷氨酰离体动物细胞系，转氨作用是主要代谢途径。

谷氨酰 胺在脱氨酶的催化下，脱氨产生氨，对细胞有毒性胺在脱氨酶的催化下，脱氨产生氨，对细胞有毒性 谷氨酰氨与丙酮酸发生转氨作用，生成丙氨酸，进入谷氨酰氨与丙酮酸发生转氨作用，生成丙氨酸，进入 培养液并积累培养液并积累 GlnGln能量能量: :GluGlu转化为转化为αα- -酮戊二酸，进入酮戊二酸，进入TCATCA循环流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有 毒废物的积累毒废物的积累细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系3 3 3 3、蛋白质糖基化与分泌表达、蛋白质糖基化与分泌表达、蛋白质糖基化与分泌表达、蛋白质糖基化与分泌表达蛋白质合成场所：粗糙内质网上的核糖体蛋白质合成场所：粗糙内质网上的核糖体 糖基化场所：内质网合成各种糖类，粗糙内质糖基化场所：内质网合成各种糖类，粗糙内质 网腔内和高尔基体，加工修饰网腔内和高尔基体，加工修饰 不同细胞系糖基化特征不同，选择适宜细胞不同细胞系糖基化特征不同，选择适宜细胞 系 对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放 到胞外，完成了蛋白质的分泌表达。

到胞外，完成了蛋白质的分泌表达细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系4.1.2 制药动物细胞的种类4.1.2 制药动物细胞的种类目前用于制药的动物细胞有4类：原代细胞系二倍体细胞系异倍体细胞系融合的或重组的工程细胞系目前用于制药的动物细胞有4类：原代细胞系二倍体细胞系异倍体细胞系融合的或重组的工程细胞系细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系来源：原代细胞，传代细胞来源：原代细胞，传代细胞寿命：有限细胞系，无限细胞系寿命：有限细胞系，无限细胞系染色体数目：二倍体细胞系，异倍体细胞系染色体数目：二倍体细胞系，异倍体细胞系获得方式：工程细胞系，癌变细胞系获得方式：工程细胞系，癌变细胞系生长特性：贴壁依赖型，非贴壁依赖型细胞 系生长特性：贴壁依赖型，非贴壁依赖型细胞 系细胞系分类细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系概念：从动物体内直接分离得到的细胞概念：从动物体内直接分离得到的细胞特点：生长分裂不旺盛，与体内细胞相似特点：生长分裂不旺盛，与体内细胞相似应用：药物检测实验，药理研究。

应用：药物检测实验，药理研究生产药品：鸡胚细胞，兔或鼠肾细胞、淋巴细胞生产药品：鸡胚细胞，兔或鼠肾细胞、淋巴细胞1.原代细胞 primary cell1.原代细胞 primary cell细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系概念：原代细胞转接后培养的细胞概念：原代细胞转接后培养的细胞特点：细胞分裂增殖旺盛，二倍体核型特点：细胞分裂增殖旺盛，二倍体核型二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆、 纯化后，获得具一定特征的细胞系二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆、 纯化后，获得具一定特征的细胞系药品生产：WI－38、MRC－5、2BS等药品生产：WI－38、MRC－5、2BS等2.传代细胞 passage cell2.传代细胞 passage cell细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系概念:生长和寿命有限的细胞系二倍体细胞系概念:生长和寿命有限的细胞系二倍体细胞系特点：多次传代培养，失去增殖能力，老化死亡特点：多次传代培养，失去增殖能力，老化死亡寿命：取决于细胞来源的物种和年龄、器官寿命：取决于细胞来源的物种和年龄、器官。

人细胞最高培养次数为50－60代人细胞最高培养次数为50－60代胚成纤维细胞：人，50代；鸡胚，30代；小鼠，8代胚成纤维细胞：人，50代；鸡胚，30代；小鼠，8代3.有限细胞系Finite cell line 3.有限细胞系Finite cell line 细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系概念：生长和寿命不受限制的细胞系，能连续 传代培养概念：生长和寿命不受限制的细胞系，能连续 传代培养连续细胞系：Continuous cell line连续细胞系：Continuous cell line永久性细胞系：Immortal cell line永久性细胞系：Immortal cell line特点：细胞无限分裂, 不具有接触抑制现象， 不出现异常染色体特点：细胞无限分裂, 不具有接触抑制现象， 不出现异常染色体理想的药物生产细胞系.理想的药物生产细胞系.4.无限细胞系Infinite cell line4.无限细胞系Infinite cell line细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系概念：概念： 采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进 行了修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的 独特性状的细胞系。

采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进 行了修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的 独特性状的细胞系 方法：方法： 正常细胞异倍体化；融合或重组正常细胞异倍体化；融合或重组5.工程细胞系5.工程细胞系细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系概念：概念： 染色体的断裂变成异倍体，失去了正常细胞的特 点，而获得了无限增殖的能力染色体的断裂变成异倍体，失去了正常细胞的特 点，而获得了无限增殖的能力 特点：特点： 长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等 要求较低，适于大规模工业化生产长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等 要求较低，适于大规模工业化生产6.转化细胞系6.转化细胞系细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系4.1.3 生产用细胞系4.1.3 生产用细胞系1. 人源细胞系1. 人源细胞系Namalwa：Namalwa：类淋巴母细胞，非整体，悬浮生长类淋巴母细胞，非整体，悬浮生长英国Wellcome公司：Sendai病毒诱导，大规模生产 α干扰素，批准上市产品逐渐淘汰英国Wellcome公司：Sendai病毒诱导，大规模生产 α干扰素，批准上市。

产品逐渐淘汰细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系作为反应器用于制药：EPO，tPA作为反应器用于制药：EPO，tPA作为宿主细胞用于制药：病毒性疫苗作为宿主细胞用于制药：病毒性疫苗杂交瘤细胞：单克隆抗体，诊断、治疗杂交瘤细胞：单克隆抗体，诊断、治疗组织再生与器官移植（个体克隆）：组织再生与器官移植（个体克隆）：本身作为产品：皮肤移植，干细胞治疗本身作为产品：皮肤移植，干细胞治疗药学研究应用：分子与细胞药理、毒理、代谢药学研究应用：分子与细胞药理、毒理、代谢生命科学研究：器官发生，细胞、分子、遗传学生命科学研究：器官发生，细胞、分子、遗传学动物细胞培养的应用动物细胞培养的应用细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系WI-38：Wistar Institute（WI），二倍体成 纤维细胞系，寿命有限贴壁生长，对很多病 毒敏感，第一个被用于制备疫苗WI-38：Wistar Institute（WI），二倍体成 纤维细胞系，寿命有限贴壁生长，对很多病 毒敏感，第一个被用于制备疫苗MRC-5：二倍体成纤维细胞系，生长较WI-38 快，对逆境有一定抗性，用于制备疫苗。

MRC-5：二倍体成纤维细胞系，生长较WI-38 快，对逆境有一定抗性，用于制备疫苗1. 人源细胞系1. 人源细胞系细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系CHO细胞：Chinese hamster ovary，亚二倍体CHO细胞：Chinese hamster ovary，亚二倍体多种衍生突变株多种衍生突变株贴壁型生长，也可悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高 的忍受能力贴壁型生长，也可悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高 的忍受能力最为普遍和成熟表达糖基化蛋白药物的细胞最为普遍和成熟表达糖基化蛋白药物的细胞药物：tPA、EPO、HBsAg、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶I药物：tPA、EPO、HBsAg、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶I2.哺乳动物细胞系2.哺乳动物细胞系细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系BHK－21：baby hamster kidneyBHK－21：baby hamster kidney成纤维样细胞，非整倍体，用于增殖病毒、制 备疫苗和重组蛋白成纤维样细胞，非整倍体，用于增殖病毒、制 备疫苗和重组蛋白。

上市重组凝血因子Ⅷ上市重组凝血因子Ⅷ2.哺乳动物细胞系2.哺乳动物细胞系细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞培养制药工艺细胞系细胞系杂交瘤细胞：hybridoma杂交瘤细胞：hybridoma脾脏B细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞脾脏B细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞特点：无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染 和生长，大量分泌和高效表达特点：无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染 和生长，大量分泌和高效表达应用：抗体药物生产。