10章 组学研究技术.ppt

物理图谱 基因转录图谱 基因组功能分析技术 生物信息学技术 主要内容 物理图谱 物理图谱（physical map） 测定DNA分子， 绘制构成基因组的全部基因的排列和间距 即直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组 的实际位置 目的 把基因的遗传信息 在染色体上的相对位置 线性而系统地排列出来 染色体上每个DNA片段的顺序 以已知核苷酸序列的DNA片段 （STS）为为“路标标”，以碱基对对 （bp，kb，Mb）作为为基本测测 量单单位（图图距）的基因组图组图 物理图谱 物理图的距离 依作图方法而异 ★ 辐射杂种作图的计算单位为厘镭(cR) ★ 限制性片段作图与克隆作图 图距单位为碱基对(bp) 【cR (厘镭):在确定的辐射剂量下染色体断裂的百分率 物理图谱要素 序列 位置 长的序列中 ▲ 物理图：标明各个序列的路标 ▲ 通过分子杂交的办法 利用DNA双链互补特点 一个DNA片段杂交在这个位置 说明这个位置的结构与它相似~即这个位置的标记 以序列作为标记的位置 物理作图的方法 ★ 限制酶作图 (Restriction Mapping) ★ 基于克隆的基因组作图(clone-based mapping) ★ 荧光原位杂交 (Fish, Fluorescent in situ hybridization) ★ 序标位作图 (STS，Sequence taged site) 物理图谱的意义 获得分布于整个基因组的30000个序列 标签位点（sequence tagged site,STS），使基 因组每隔100kb距离就有一个标记 在此基础上构建覆盖每条染色体的大片 段DNA克隆 如： ● 酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome,YAC） ● 细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome,BAC） ● 人工附加染色体 （human artificial episomal chromosome,HAEC） ● 人工噬菌体染色体 （P1 bacteriophage artificial chromosome,PAC） 等连续克隆(Contig) 限制酶作图 DNA链的限制性酶切片段的排列顺序 即酶切片段在DNA链上的定位 限制性内切酶在DNA链上的切口是以特异序列 为基础的，核苷酸序列不同的DNA，经酶切后就 会产生不同长度的DNA片段，构成独特的酶切图 谱(Restriction Mapping)。

又称DNA物理图谱 DNA分子结构的特征之一 DNA是很大的分子，限制酶产生用 于测序反应的DNA片段只是其中的极小 部分，这些片段在DNA链中所处的位置 关系~即DNA物理图谱解决的问题 DNA物理图谱是顺序测定的基础 指导DNA测序的蓝图 Why ??? 限制性作图 ▼ 将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置 只能应用于较小的DNA分子 ▼ 上限取决于作图分子中限制酶位点的频率 ▼ 采用6碱基对识别顺序的限制酶 适合﹤ ﹤50KbDNA分子的精确作图 限制酶作图 基本原理 把庞大的DNA先“敲碎”，再拼接 以Mb、kb、bp作为图距 以STS（sequence tags site）探针序列为路标 主要是把含有STS对应序列的DNA的克隆片段 连接成相互重叠的“片段重叠群（contig） （1）完全降解 选择合适的限制性内切酶 完全降解待测DNA链(同位素标记) 凝胶电泳分离→ →自显影→ →获得图谱 即组成该DNA链的酶切片段数目和大小 基本步骤 同位素标记 32P 限制性内切酶 电泳 末端标记待测DNA的一条链 (同位素) 酶部分降解 控制反应条件使DNA链上酶切口随机断裂 避免所有切口断裂的完全降解 电泳分离→ →自显影 比较自显影图谱 根据片段大小及彼此间的差异 排出酶切片段在DNA链上的位置 （2）部分降解 12 比较 排出酶切片段 完整的物理图谱应包括 基因组的不同载体DNA克隆片段重叠群图 大片段限制性内切酶切点图 DNA片段或一特异DNA序列（STS）的路标图 基因组中广泛存在的特征型序列等的标记图 （如CpG序列、Alu序列，isochore） 【具有mosaic结构,称为isochore。

即基因组是由一些较长的大片 段（平均长度>>300 Kb）组成, GC含量相对均匀,而在这些大片段的两 端GC含量是跃变的,而不是渐变的】 荧光原位杂交 (Fish, Fluorescent in situ hybridization) 将探针用荧光标记，与细胞分裂中 期的染色体杂交，用荧光显微镜观 察信号所处的位置，将探针标定在 连锁图上 荧光原位杂交 （fluorescent in situ hybridization，FISH） 荧光原位杂交 （fluorescent in situ hybridization，FISH） 荧光原位杂交 （fluorescent in situ hybridization，FISH） 荧光原位杂交 （fluorescent in situ hybridization，FISH） 用DNA纤维分析水稻第4号染色体 基于克隆的基因组作图 大片段DNA的克隆载体 ◆ YAC: 酵母人工染色体 230-1700Kb ◆ BAC: 细菌人工染色体 300Kb ◆ PAC: P1人工染色体 300Kb ◆ Cosmids: 30Kb 重叠群(Contig) ：相互重叠的DNA片段组成的物理图 Contig组建方法: 染色体步移 指纹作图 v克隆作图 构建全基因组 DNA 基因文库 构建指定单一染 色体的基因文库 PCR检测STS 分子标记 根据重叠STS标记 绘制克隆连锁图 提取基因 组DNA 流式细胞仪 分离染色体 打断 打断 染色体步移 原理 chromosome walkingchromosome walking 酶切，插入 A基因探针 筛选 亚克隆片段重新筛选 亚克隆片段重新筛选 λ亚克隆1 相邻λ亚克隆2 指纹：确定DNA样品所具有的DNA片段 一个克隆的指纹 即表示该克隆所具有的限定的顺序特征 克隆指纹分析原理 如果2个克隆彼此重叠 它们一定含有相同的序列 克隆指纹主要用于重叠群(Contig)的构建 指纹分析方法 n 限制性带型(restriction patterns)指纹 n 重复顺序DNA指纹(repetitive DNA fingerprints) n STS目录作图(STS content mapping) n 重复DNA PCR(repetitive DNA PCR) 或分散重复顺序PCR指纹 (interspersed repeat element PCR, IRE- PCR) 限制性片段指纹 重叠顺序DNA指纹 STS指纹 Contig 序标位(STS)作图 u 长度: 100-500 bp u 序列已知, 可以设计PCR反应 u 单拷贝, 在染色体上的位置是唯一的 u EST (Expressed sequence tag) 可以作STS STS： sequence tag sit STS作图原理 成套片段 2个标签同时出现 在6个大片段中 只有2个大片段有2个标签 染色体DNA STS作图原理 寻找STS的方法 表达顺序标签(expressed sequence tag，EST) 从cDNA中找到的小段顺序 基因家族成员间共有的序列不能用于STS SSLP （simple sequence length polymorphisrns） 随机基因组顺序 表达顺序标签EST 随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序 所获得的部分cDNA序列即EST ● EST是一个cDNA克隆快速大规模测序后 所获得的３’端和５’端部分cDNA随机片段 ● 每个EST长度约200～600bp 代表了一个单拷贝基因的部分cDNA表达序列 大多数EST的长度不足400bp Why ？？？ 一个基因转录本的cDNA序列 可能包含多个序列重叠的EST 一个基因mRNA剪接点不同 可以获得多个cDNA克隆 那么，EST既可能对应于一个cDNA的某一部分 又可能代表mRNA的不同剪接方式 基因转录图谱 （transcription map） 转录图谱(基因图谱) 在识别基因组所包含的蛋白质编码 序列的基础上 绘制的结合有关基因序列、位置及 表达模式等信息的图谱。

即利用EST作为标记所构建的分子遗传图谱 （gene map） Or transcription map: 在人类基因组中鉴别出占2%至5%的全部 基因的位置结构与功能 基本原理： 蛋白质推测mRNA的序列，mRNA反转录 为cDNA，然后利用其与所测序列进行杂交 ，鉴别出与转录有关的基因 基本原理 生物性状和疾病→ →由结构或功能蛋白质决定 已知的蛋白质→ →由mRNA编码 mRNA反转录→ 合成cDNA → 即EST的cDNA片段 用这种稳定的cDNA或EST → →作为“探针” 进行分子杂交 鉴别出与转录有关的基因 基本原理 或用PolyA互补的寡聚T 或克隆载体的相关序列作为引物 对mRNA双端尾侧的几百个bp进行测序 得到。