海洋生物技术第六章 海产蓝藻基因工程.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑海洋生物技术第六章 海产蓝藻基因工程 第六章 海产蓝藻基因工程 一、蓝藻简介与分类 蓝藻是原核生物，又叫蓝绿藻 蓝细菌；大多数蓝 藻的细胞壁外面有胶质衣，因此又叫粘藻在全体藻类生物中，蓝藻是最简朴、最原始的一种 蓝藻是单细胞生物，没有细胞核，但细胞中央含有 核物质，通常呈颗粒状或网状，染色质和色素平匀 的分布在细胞质中 该核物质没有核膜和核仁，但具有核的功能，故称 其为原核(或拟核) 在蓝藻中还有一种环状DNA——质粒，在基因工程 中担当了运载体的作用和细菌一样，蓝藻属于 “原核生物” 蓝藻属蓝藻门分为两纲：色球藻纲和藻殖段纲 色球藻纲藻体为单细胞体或群体；藻殖段纲藻体为丝状体，有藻殖段 蓝藻在地球上大约展现在距今35~33亿年前，已知蓝藻约2000种，中国已有记录的约900种 分布特别广泛，广泛世界各地，但大多数(约75%)淡水产，少数海产 在我国三亚湾海疆，主要以来自外海的外源性 海洋蓝藻束毛藻为主要优势群落, 其次有共生 蓝藻胞内植生藻Richeliaintracel luularis 和单细胞蓝藻集胞藻属Synechocystis。

在珊瑚礁生态系统中, 蓝藻呈多样性分布, 有 集胞藻属、鱼腥藻属Anabaena、念珠藻属 Nostoc、眉藻属Catothrix 、颤藻属Oscil latoria 和鞘丝藻属Lyngbya 红树林生态系统中蓝藻主要以颤藻为 主要优势种, 其次是鞘丝藻也占重要 的比例 海洋近岸微型海藻垫中, 有些群落主 要以颤藻属和鞘丝藻属为主, 有些微藻垫以眉藻属为主要优势属种, 蓝藻 种群随季节的变化有明显的演替 二、海产蓝藻基因工程 1. 2. 3. 4. 5. 海藻生物技术的进展体验了5个进展阶段 50年头的组织培养, 60年头的传统育种, 70年头的养分细胞一原生质体技术, 80年头的固定化技术和大分子技术, 90年头将进入分子生物学和基因工程时 代 海产蓝藻基因工程——研究现状1. 从钝顶螺旋藻中克隆了海带基因工程育种的 目的基因, 并实现了在大肠杆菌中的高效表 达, 表达产物较自然蛋白具有显著的抑制肿 瘤、延长生命及促进免疫系统活性作用 2. 从钝顶螺旋藻中首次分开到质粒, 有证据表 明质粒与形态有确定关系, 该结果发表后国 内外大量单位索要单行本。

正在构建细菌-螺 旋藻重组载体 3. 从我国特产的红藻-真江篱中分开到质粒, 正 在研究其功能和构建重组载体 4. 确定了CaMV35S启动子在大型褐藻中的通 用性, 用基因枪转化海带、裙带菜外植体, 已获得GUS基因的瞬间表达, 进一步的工 作正在举行中 研究了制备钝顶螺旋藻透性体、形成克隆 和遗传筛选的方法, 为遗传转化奠定了基 础 研究了海带和螺旋藻遗传选择标记 5. 6. 三、海产蓝藻布局基因组研究(一)原绿球藻基因组研究 1. 海洋单细胞蓝藻———原绿球藻直径约为 0. 5~0. 7μm ,是目前已知最小的自养 光合生物,它广泛分布于热带和亚热带海 域 2. 目前,完成序列测定工作的原绿球藻共有3 种：Prochlorococcus marinus SS120 , Prochlorococcus marinus MIT 9313, Prochlorococcus marinusMED4 (二)海洋聚球藻基因组研究1. 聚球藻( Synechococcus sp . ) 是一临时的分类单位,包 括球状和杆状蓝藻,它主要限定于包含叶绿素a1 和藻胆体 布局的蓝藻。

目前正在举行海洋聚球藻基因组筹划的有聚球藻PCC7002 2. 和聚球藻WH8102 其中,聚球藻WH8102 的基因组信息已在NCBI上公布出来3. 这些基因大多与聚球藻的运动性、糖转移酶以及噬蓝藻体 相关, 此外, 它还编码了藻胆体基因簇和硝酸盐恢复酶相关基因,这些基因都与它识别于原绿球藻的独特生态适应性 有关 海产蓝藻布局基因组研究 海产蓝藻布局基因组研究 海产蓝藻功能基因组研究 关于蓝藻的基因序列数据涵 盖了诸如细胞分化、光合作用 以及初级代谢和次级代谢的相 关基因 四、海产蓝藻基因转移系统常用两种类型的基因转移系统 1.遗传转化自然转化、诱导转化、电击穿孔和基因 枪转化 2.接合转移构建穿梭载体再接合转移 1、自然转化 (一)遗传转化 蓝藻作为基因工程受体系统，兼具微生物和 植物的优点，其细胞布局和遗传特性与革兰氏阴性 细菌类似，片面种类的蓝藻具有自然转化和有效重 组系统，在对数生长期不经任何处理即可直接吸收 外源DNA,因此，适用于大肠杆菌的各种分子生物学 操作也同样适用于某些具有自然感受态的不产生异 型胞的单细胞藻类(王业勤等，1991)。

1970年首次在聚球藻S.PCC 7943中察觉外源 DNA的自然转化作用(Shestakov et al.,1970) 蓝藻自然转化的机制仍不领会 优缺点自然转化在各类蓝藻基因转移系统中，具有操作 简便的优点，但这类基因转移系统主要适用于具 有自然感受态且无异型胞分化的单细胞种类(秦 松等，1994a),如聚球藻S.7943、6301、7942、7002和集胞藻S.6714、6803、6906(陈颖等， 1999),因而适用范围窄；选用自然转化系统来 直接转化外源DNA的告成机率和转化效率均较低 (闵红涛等，1995) 2、诱导转化是指通过人工诱导感受态来引入外源DNA的方 法有一些蓝藻不具有自然感受态，可以通过诱 导的方法使其处于感受态，从而易于吸收外源基 因 常用的诱导方法包括用Ca2+或EDTA处理以及用 溶菌酶制备原生质体等闵红涛等(1995)用溶 菌酶处理聚球藻S.PCC 6301细胞诱导人工感受态， 并用外源质粒pBR325转化受体细胞表达氯霉素抗 性，转化频率近5.010-5转化子细胞，用转化子 DNA再举行次级转化，转化频率可达5.010-4转化 子细胞。

优缺点相对于自然转化，诱导转化可通过人工诱导感受 态来扩大其适应范围，就转化效率而言，对同种 藻株采用诱导转化要比用克隆的DNA举行自然转化 的效率高(闵红涛等，1995),而且诱导转化的 重复性较好，但由于影响诱导转化的因素较多， 需要不断摸索并改善影响转化效率的相关条件， 使之达成较高水平诱导转化主要适用于缺乏天 然感受态的蓝藻株系，如集胞藻S.6308其它一 些具有自然感受态的蓝藻株系也可以通过诱导转 化来提高其转化效率，如聚球藻S.6301、7002等 Verma等(1990)报道，用溶菌酶处理念珠藻 Nostoc muscorum形成的感受态也可提高其转化效 率 3、电击转化电击转化是借助外界电压使细胞膜产生瞬间可 逆穿孔，从而把外源DNA引入细胞的方法电击转 化是一种新的转化手段，虽然是一种简朴的基因 转移方法，但是其转化频率明显高于化学转化方 法由于其高效、低毒、普及和可控等优点，已 开头广泛用于蓝藻基因工程，更加针对有异型胞 的丝状蓝藻来说，它是一种很好的转化手段 — 7 —。