肝素的抗凝血作用实验报告.docx

为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划肝素的抗凝血作用实验报告　　试验8肝素对小鼠的抗凝血作用　　【目的】　　1.熟悉抗凝血药的筛选方法　　2.观察肝素的抗凝作用和硫酸鱼精蛋白的解救效果原理】　　肝素为硫酸化的糖胺聚糖，分子量为3~30kDa，其中硫酸根约占40%，硫酸根呈强酸性，带大量负电荷肝素能增强抗凝血酶Ⅲ与凝血酶等活化型凝血因子的亲和力，产生体内外抗凝作用，主要灭活IIa和Xa，也灭活IXa,XIa,XIIa,激肽释放酶和纤溶酶等　　硫酸鱼精蛋白呈碱性，带有大量正电荷，如果肝素过量造成出血，则可用硫酸鱼精蛋白中和解救材料】　　1.器材：注射器、电子秤、玻片、针头；　　2.药品：%肝素溶液、生理盐水、1%硫酸鱼精蛋白，苦味酸；3.动物：小鼠12只，20g左右，雌雄兼用试验步骤】1.小鼠标记，称重；　　2.分组，分为3组，每组4只，分别为A、B和C组；3.给药：　　A组：腹腔注射生理盐水，ml/10g，10min后测定凝血时间；B组：腹腔注射肝素，ml/10g，10min后测定凝血时间；　　C组：腹腔注射鱼精蛋白，ml/10g；10min后腹腔注射肝素，ml/10g，10min后测定凝血时间；4.测定凝血时间的方法　　①眼球后静脉丛取血2滴。

眼球后静脉丛取血法：左手拇指及中指抓住头颈部皮肤，左手掌尽量将小鼠全身皮肤向左移，慢慢使小鼠右眼球突出，小鼠头向下充血取长约2cm的毛细管从内皉间45度角进针，至有抵骨　　质的感觉，然后毛细管向外拔出约1-2mm即可有血滴流出　　②采出的血滴分别置于洁净的玻片上，计时；　　③每隔30s用针头自滴血内连续挑起纤维丝为止，计时另一滴血作为最后挑起纤维丝的对照　　④正常小鼠血液的凝血时间为，如果观察10min无凝血可计时为10min　　5.汇总全实验室结果，数据统计分析，得到平均值，标准偏差，StudentT-Test得到P值结果】　　表1小鼠的凝血时间　　表2全实验室小鼠凝血时间　　组别A组B组C组　　【注意】　　玻片法挑动血滴，经横贯血滴直径，连续能挑起纤维丝为凝血时间终点如果过分挑动，变成纤维血滴则始终不出现纤维丝，所以同时放2滴血，核对另外一滴血很有必要组1　　组2　　每个实验小组的平均值组3　　组4　　组5　　组6　　组7组8　　T　　P值　　影响血液凝固的因素　　实验目的：通过本实验来了解血液凝固的基本过程及了解影响血液凝固的一些因　　素　　实验对象：家兔　　实验步骤：　　实验结果：　　1、观察纤维蛋白原在凝血过程中的作用：实验中可见到静置杯内血液发生凝固。

搅拌杯　　内血液不凝固，但在毛刷上见到红色的血凝块，经水冲洗后毛刷上缠绕有白色丝状物　　2、观察影响血凝的一些理化因素：如下表9-1所示表9-3影响血凝的一些理化因素实验条件　　1.加少许棉花　　2.用石蜡油均匀涂试管内壁　　3.放置37℃水浴　　4.放置冰水水浴　　5.加肝素10个单位　　6.加草酸钾2mg　　3、观察内源性及外源性凝血过程：如下表9-2所示表9-2内源性和外源性凝血过程的观察试剂　　1、富血小板血浆　　2、少血小板血浆　　3、生理盐水　　4、羊肺悬液　　5、/lcacl2血液凝固时间　　讨论：　　血液凝固是指血液由流动的液体状态变为不流动的冻胶状态血液凝固过程大致分为三个　　主要阶段：①凝血酶原激活物形成；②凝血酶原激活成凝血酶，③纤维蛋白原转变为纤维蛋　　白在凝血酶原激活物的形成过程中分有两种不同的途径：内源性凝血途径和外源性凝血途　　径内源性凝血途径是由凝血因子?启动的，参与血凝的全部凝血因子都在血浆内凝血因子?　　可被各种带负电荷的物质等所激活，如血管内膜暴露的胶原纤维、玻璃、陶器等外源性凝　　血途径是由存在于血管外组织中的凝血因子ⅲ所启动的，其余参与的凝血因子也在血管内。

　　凝血因子ⅲ在脑、肺、胎盘组织含量很丰富不管是内源性凝血途径或外源性凝血途径，他们最后的是使血纤维蛋白的形成而使血液　　发生凝固在观察纤维蛋白原在凝血过程中作用的实验中，由于参与凝血的全部凝血因子都　　在血浆中，因此其凝血过程是属于内源性凝血由于玻璃和毛刷表面都带有负电荷，后者可　　激活凝血因子?，启动内源性凝血过程凝血到最后阶段时，在凝血酶的作用下，把纤维蛋白　　原水解成血纤维蛋白；形成的纤维蛋白不断地交叉成网状结构，把血液中的所有血细胞网凝　　血时间50’’8’15’’2’15’’6’45’’不凝不凝试管1mlmlml2’　　15’’试管2mlmlml3’45’’试管3mlmlml45’’罗于其中，从而使血液发生凝固静置杯中的血液，由于发生了上述的血液凝固过程，　　所形成的纤维蛋白没有被破坏，所以杯中血液凝固而搅拌过的杯内血液，虽也发生血液凝　　固过程，但所形成的纤维蛋白却不断缠绕到毛刷上，当杯内血液的纤维蛋白原全部水解掉后，　　形成的纤维蛋白也全部缠绕在毛刷上，这时血纤维只能网罗毛刷附近的一些血细胞，在毛刷　　上见有血凝块经水漂洗后，血细胞被冲走，毛刷上剩下的是白色细丝状的纤维蛋白。

搅拌　　后的杯内血液因纤维蛋白原全部被耗尽，无法再形成纤维蛋白，则搅拌后的杯内血液不发生　　凝固由此可见，血液凝固的过程实际上是纤维蛋白形成的过程，任何一个步骤被破坏，就　　不会引起血液凝固　　在血液凝固的两个过程中，它们是有所不同的两者的主要区别如下表9-3所示：表　　9-3内源性和外源性凝血的主要区别区别点　　启动的凝血因子　　ｘ因子的激活　　参与凝血的凝血因子　　凝血过程　　凝血时间内源性凝血?需要?因子复合物数量多，且全部在血管中复杂慢、约数分　　钟外源性凝血ⅲ需要ⅲ因子复合物数量少，ⅲ因子在血管外，其余在血管内简单快、　　约几十秒钟　　由上可知，外源性凝血比内源性凝血所需的时间短在实验结果表9-2中，第1、2试管　　都是由血小板、生理盐水和cacl2溶液组成的，参与凝血的凝血因子都在血浆中，故其凝血　　过程为内源性凝血而第3试管是由血小板、羊肺悬液和cacl2溶液组成在第3试管中含　　有羊肺悬液，其内含有丰富的第ⅲ凝血因子显然第3试管发生的血液凝固过程主要是外源　　性凝血途径因此第3试管凝血时间最快在第1、2试管中虽然所含成分相同，但血小板含　　量不一样，第1试管血小板含量高于第2试管。

血小板对血液凝固具有促进作用，表现为：　　①血小板的质膜上吸附有许多凝血因子，如纤维蛋白原、因子v、因子xi等②其α颗粒中　　也含有许多凝血因子以及血小板因子③血小板因子为血液凝固过程提供磷脂表面，其激活　　后能加速血凝；同时其能对一些血凝因子具有保护作用，免受抗凝血酶ⅲ和肝素的破坏可　　见，第1试管内因含有丰富的血小板，故其凝血时间比第2试管快血液凝固受许多因素的影响，如凝血因子的质和量、各种理化因素等棉花给血液凝固提供一个粗糙表面，容易使血小板发生粘着、聚集，然后发生解体，释　　放许多凝血因子和血小板因子；另外，棉花含许多带负电荷植物纤维，也能激活凝血因子?，　　启动内源性凝血途径因此放有棉花的试管内血液凝固加快试管内壁涂上一层石蜡油时，　　由于石蜡油表面光滑，不易引起血小板粘着，即不易使血小板发挥促进凝血的作用另外石　　蜡油为绝缘体，其把试管表面所带的负电荷覆盖，不利于凝血因子?的激活，因此血液凝固变　　慢　　血液凝固实际上是一系列蛋白酶的水解过程参与血液凝固的凝血因子大多数是蛋白质　　酶原，其水解后变成有活性的蛋白质酶，如因子ii、因子xi、因子xii等这些蛋白质酶具有酶随温度升高催化活性加强的特性，也具有蛋白质受热变性的特点。

　　当温度低时，蛋白质酶的活性下降，而当温度升高到42～45℃以上时，由于蛋白质发生变性，　　蛋白质的空间结构被破坏，从而使蛋白质功能受损，蛋白质酶的活性下降或失活因此，把　　血液放入37℃水浴时血液凝固的时间就比放入冰冻水浴时所需时间短体内重要的抗凝物质是抗凝血酶ⅲ和肝素抗凝血酶ⅲ与凝血酶等多种凝血因子的活性　　中心------丝氨酸残基结合，使这些凝血因子的活性受到抑制或失活，从而达到抗凝作用　　肝素则主要通过与血浆中的一些抗凝蛋白，如抗凝血酶ⅲ结合，加强后者的抗凝作用此外，　　肝素还能使血管内壁细胞释放凝血抑制物和纤溶酶原激活物，增强纤溶作用因此在试管内放入肝素时血液不会发生凝固　　血凝过程中，ca是重要的凝血因子，其参与了血液凝固的许多环节，当血液中没有ca2+　　时血液就不会发生凝固在试管内放有草酸钾时，由于草酸钾与血液中的ca2+发生化学2+反应，生成草酸钙沉淀，使血液中没有ca，故血液不会发生凝固　　结论：　　通过本实验可知：①血液凝固过程可分为三个互相联系的主要阶段，任何一个阶段被破　　坏，凝血过程就终止，而血液凝固的过程实际上是纤维蛋白形成的过程②根据凝血酶原激　　活物形成的途径不同，可把血液凝固分为内源性和外源性两条凝血途径，内源性凝血途径所　　消耗的时间比外源性凝血途径长。

③血小板在血液凝固过程中具有发挥促进作用④血液凝　　固除受凝血因子的质和量影响外，还受接触面、温度等理化因素的影响血液接触面粗糙、　　适当加温能加速血凝，而血中加肝素等抗凝剂、以及除去血中游离钙离子等可延缓血液凝固　　2+篇二：血凝血凝抑制试验总结　　1、如果是马上要做实验，先把实验所需的抗原、标准阳性血清、阴性血清、待检血清　　取出　　回温，如果待检血清已冷藏，可取出放入37℃恒温培养箱中回温，待血清析出后取出　　2、试验准备阶段：　　a准备好清洗干净的血清离心管b采血：注射器内先加入一半体积的阿氏液c1%红细胞悬液的制备采集至少3只spf公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液　　与等体积的阿氏液混合，用ph、mol/lpbs液洗涤3次，每次去掉上层的清液后加　　入少量pbs用注射器反复抽吸使之混匀，再加至所要刻度，放入离心每次均以1000r/min　　离心10min，洗涤后用pbs配成体积分数为1%的红细胞悬液，4℃保存备用　　d所需1%红细胞悬液的体积≥4hau+1ml，否则配置　　的1%红细胞悬液不够用e阿氏液制备葡萄糖g　　柠檬酸钠g　　柠檬酸　　氯化钠g　　加蒸馏水至100ml，散热溶解后调ph值至,69kpa高压灭菌15min，4℃保存备　　用。

　　3、血凝试验　　目的：检测试验所用的标准抗原的血凝滴度，如检测结果血凝滴度为210=1024，表示　　标准抗原稀释1024倍仍能与红细胞发生凝集反应注意：　　一瓶新的未使用的抗原，需要加入2ml的稀释液　　a反应板要同时做三排，原因：根据三排的多数结果来确定血凝滴度例　　如：　　10999三个结果为：2、2、2，则本次试验标准抗原血凝滴度为2b加入1%的红细胞悬液后放到微量震荡器上震荡混合1min，室温20℃～25℃下静置40　　min，放4℃静置60min当pbs对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果　　4、4hau抗原　　例如：标准抗原血凝滴度为210=1024，则4hau抗原=/4=1：256，稀释　　时，将1ml的抗原加入到255ml的pbs中即为4hau　　5、计算配置4hau所需稀释液体积v和标准抗原体积x假设：待检血清100份每排12个孔每孔加入2。