抗除草剂转基因作物.ppt

第五章 转基因植物 1.植物的转基因技术 2.转基因植物的筛选与检测 3.改进转基因的技术 4.农作物基因工程 5.生物反应器 6.转基因植物的安全性 第五章 转基因植物 • 是指利用基因工程技术，在离体条件下 ，对不同生物的DNA进行加工，并按照 人们的意愿和适当的载体重新组合，再 将重载体转入受体中，并使其在体内表 达的植物 • 转基因植物通常具有高产优质、抗病虫 、环境抗性、抗除草剂、耐储存、提高 某些成分的含量等优良性状 第一节 植物转基因技术 一、植物细胞培养技术 植物组织培养的重要理论基础是植 物细胞的全能性植物细胞全能性 (totipotency)，就是植物体细胞或性细胞 ，在人为控制的培养条件下都具有再生 成新个体的潜能，因而在适宜的条件下 可以被诱导生长分化形成完整植株 二、植物转基因技术的基本路线 1.目的基因的分离 2.载体构建 3.导入细菌并利用细菌繁殖扩增重组DNA 4.对植物组织或细胞进行转化 5.植株再生 6.转基因植株的鉴定 7.转基因植株的种植 三、转基因的受体系统 1．植物组织受体系统： 受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染 这些病毒或质粒上的某些DNA通过各种不同的 方式转移到受伤的植物细胞，并形成愈伤组织 。

愈伤组织可以培养成完整的转化植株该受 体系统转化率高，可获得较多的转化植株，取 材广泛、适用性广但再生植株无性系变异较 大，转化的外源基因稳定性差，嵌合体多 2．原生质体受体系统： 是植物细胞除去细胞壁后的部分，是 一个质膜包围的“裸露细胞”原生质体在合 适的条件下具有分化、繁殖并再生成完整 植株的能力，具有全能性原生质体在体 外比较容易完成一系列细胞操作或遗传操 作，互相之间可以发生细胞融合，而且还 可以直接高效的捕获外源基因，嵌合体少 但缺点是遗传稳定性差，培养周期长， 难度大，再生频率低 3．生殖细胞受体系统： 它是以植物生殖细胞如花粉细胞、卵细胞为受体 细胞进行基因转化的系统目前主要以两条途径利用 生殖细胞进行基因转化：一是利用组织培养技术进行 花粉细胞和卵细胞的单倍体培养，诱导愈伤组织细胞 ，进一步分化发育成单倍体植株，从而建立单倍体的 基因转化系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程 进行基因转化，如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子 房微针注射法等由于该受体系统与其它受体系统相 比有许多优点，如：具有全能性的生殖细胞直接为受 体细胞，具有更强的接受外源DNA的潜能，一旦将外 源基因导入这些细胞，犹如正常的受精过程会收到“一 劳永逸”的效果；利用植物自身的受粉过程，具有操作 方法方便、简单。

不足之处是利用该受体系统进行转 化受到季节的限制；只能在短暂的开花期进行，且无 性繁殖的植物不能采用 4.叶绿体转化系统 外源基因可以在叶绿体中得到稳定表 达，而且还具有许多优点： （1）便于外源基因定位整合 （2）基因为多拷贝，表达量高 （3）导入的外源基因性状稳定性高 （4）能直接表达原核基因 四、外源基因导入植物的方法 （一）DNA直接转移法 1.化学刺激法 植物原生质体借助一些化学试剂（如PEG 、氯化钙等）的诱导能吸收外源DNA、质粒等 遗传物质，并有可能整合到植物染色体上去 此法对细胞伤害少，可避免嵌合体产生， 易于选择转化体，受体细胞不受种类限制 2.电击法 首先是将原生质体在溶液中与DNA混 合，利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“ 电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促 进外源DNA的摄取此法在动物细胞中应 用较早并取得很好效果，现在这一方法已 被广泛用于各种单、双子叶植物中，特别 是在禾谷类作物中更有发展潜力不但原 生质体而且完整的单细胞也可利用此法， 这对于那些难以从原生质体再生植株的植 物或许有更大意义 3.显微注射法 显微注射进行基因转化是一种比较 经典的技术，其理论和技术方面的研究 都比较成熟。

特别在动物细胞或卵细胞 的基因转化，核移植及细胞器的移植方 面应用很多，并已取得重要成果植物 细胞的显微注射在以前使用很少，但近 年来发展很快，并在理论技术上有所创 新 4.基因枪法 克莱因（Klein）等1987年首次用基因枪轰击洋 葱上表皮细胞，成功地将包裹了外源DNA的钨弹射 入其中，并实现了外源基因在完整组织中的表达 这一方法要使用一种防枪结构的装置——基因枪， 枪管的前端是封口的，上面只有直径1mm左右的小 孔，弹头不能通过其具体操作是将直径4um左右 的钨粉或其它重金属粉在外源DNA中形成悬浮液， 则外源DNA会被吸附到钨粉颗粒的表面，再把这些 吸附有外源遗传物质的金属颗粒装填到圆筒状弹头 的前端，起爆后，弹头加速落入枪筒，在枪筒口附 近被挡住，而弹头前端所带的钨粉颗粒在惯性作用 下脱离弹头，以高速通过1mm的小孔直接射入受体 ，其表面吸附的外源DNA也随之进入细胞也可以 用高压放电或高压气体使金属粒子加速 5.脂质体介导法 脂质体是由磷脂组成的膜状结构，将磷脂悬浮 在水中，在适当条件下，受到高能声波处理时，磷 脂分子群集在一起形成密集的小囊泡状结构，称为 脂质体用脂质体包裹一些DNA、RNA分子就成 了一种人工模拟的原生质体，它的外膜相当于人造 的细胞质膜。

然后与植物原生质体共保温，于是脂 质体与原生质体膜结构之间发生相互作用，而后通 过细胞的内吞作用而将外源DNA导入植物的原生质 体这种方法具有许多方面的优点，包括可保护 DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用，降低 了对细胞的毒性效应，适用的植物种类广泛，重复 性高，包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等 6.微激光束法 是利用激光脉冲引起细胞膜可逆性 穿孔，从而将外源DNA导入受体细胞 可在荧光显微镜下找出合适的细胞 ，然后用激光光源替代荧光光源，使细 胞壁被击穿，外源DNA进入受体细胞 7.花粉管通道法 这种方法最早是由周光宇1983年 建立花粉管通道法是将外源的DNA 片段在自花授粉后的特定时期注入柱 头或花柱，使外源DNA沿花粉管通道 进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞 ，转化率高达10%这一方法的建立开 创了整株活体转化的先例，可以应用 于任何开花植物 人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病 ，该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积 发生 1907年 Smith和Townsent等 首先发现这种冠瘿瘤 病是由根癌农杆菌 引发的 （二）农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化 农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化 Ø1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种 与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于200kb），称为Ti 质粒。

Ø1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿 瘤细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农 杆菌Ti质粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer- DNA）实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合 进植物基因组中并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的 发生进一步研究发现，整合到植物基因组中的T- DNA可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代，Ti 质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的 重要基础 Ti质粒为根癌农杆菌核外的一种环状双链DNA 分子，长约200Kb其中含有一段称为T-DNA的可 转移区段，当农杆菌侵染寄主细胞后，T-DNA可以 从农杆菌转移到寄主细胞内并整合到寄主细胞的基 因组中Ti质粒的这一特性为农杆菌介导法植物转 基因奠定了基础 T-DNA的长约23Kb，在其两端各有一个25bp 左右的正向重复序列，称之为T-DNA的边界序列 在不同的农杆菌Ti质粒上该序列高度保守，一般认 为右端重复序列对T-DNA的转移起决定性作用 农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化 农杆菌介导法转基因的基本流程及优化策略 生理状态 来源 植物愈伤组织的诱导 农杆菌的活化 愈伤组织 农杆菌 的共培养 抗性愈伤组织 获得及植株再生 菌 种 活化状态 培养基成分 缩短组培时间 提高再生频率 l农杆菌侵染叶片法流程 2N6诱导愈伤 7-10d N6 -BA 预培养 2-3d 种子 优化的农杆菌介导法水稻高效快速遗传转化体系优化的农杆菌介导法水稻高效快速遗传转化体系 AB-AS 诱导12h AB培养基活化12h YEP平板单菌落 液体MS浸泡15min 无生长素N6-AS共培养 3d N6-H选择培养20d 抗性愈伤组织的获得及植株再生 30d 62d~70d 1 2N6愈伤诱导2 N6-BA预培养3 N6-H选择培养 优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程 4 植株再生 二、转基因植物的筛选与检测 无论使用哪种转基因方法，转化细 胞与非转化细胞相比都只占少数。

为获 得真正的转基因植株，进行基因转化后 的第一步工作是筛选转化细胞在含有 选择压力的培养基上诱导转化细胞分化 ，形成转化芽，再诱导芽生长、生根， 形成转化植株第二步是对转化植株进 行分子生物学鉴定第三步则是进行性 状鉴定及外源基因的表达调控研究 一、抗性基因 一般用抗性基因来富集转化细胞 抗性基因应满足以下几点： 1.抗性基因应是显性基因 2.在选择压力下，转化细胞能继续生长，而非 转化细胞受到抑制，从而使转化子得到富集 3.抗性基因产物本身不能对转化细胞的生长或 发育有抑制作用 4.选择物价廉易得 1.抗生素抗性基因 1.npt 新霉素磷酸转移酶基因，对卡那霉素 、巴龙霉素、新霉素具有抗性 2.aphIV 潮霉素磷酸转移酶基因，对潮霉素 具有抗性 3.spt 链霉素磷酸转移酶基因，对链霉素具 有抗性 4.cat 氯霉素乙酰转移酶基因，使氯霉素丧 失抗生素活性 2.抗除草剂基因 • 除草剂抗性基因在植物遗传转化中 可同时用作选择标记和培养抗除草 剂的作物 • 抗除草剂基因主要有抗PPT的bar和 pat基因以及抗草甘膦的epsps基因 二、显色或发光报告基因 1.GUS酶活性检测 gus基因存在于某些细菌体内，编码β-葡萄糖苷 酶（β-glucuronidase，Gus），该酶是一种水解酶， 能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。

因为绝大 多数植物细胞内不存在内源的Gus活性，因此gus基 因广泛用作转基因植物的报告基因，尤其是在研究 外源基因瞬时表达的转化实验中广泛应有此外， gus基因3’端与其他结构形式的融合基因也能够正常 表达，所产生的融合蛋白仍具有Gus活性，这对研究 外源基因表达的具体细胞部位提供了方便条件，也 是它相对于其他报告基因的一个优点 主要有一下三种检测方法： （1）组织化学染色定位法 该法以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯（X -Gluc）为底物，通过显色反应可直接观察到组织器 官中gus基因的活性该方法不用将酶从组织中提取 出来，而是使底物进入被测的植物组织、细胞或原 生质体之中将被测材料浸泡在含有底物的缓冲液 中保温，若组织、细胞、原生质体发生了gus基因转 化，表达出GUS，在适宜条件下该酶可将X-Gluc水 解生成蓝色物质，初始产物并不带颜色，为无色的 吲哚衍生物，后经氧化二聚作用形成5,5’-二溴-4,4’- 二氯靛蓝染料，此靛蓝染料使具有Gus活性的部位 或位点呈现蓝色，可用肉眼或在显微镜下观察到 （2）荧光法测定Gus活性 该法以4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸苷酯（4- MUG）为底物，Gus催化其水解为4-甲基伞形酮（4- MU）及β-D葡萄糖醛酸。

4-MU分子中的羟基解离后 被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分 光光度计定量具体测定时有两种做法:①仅在一个 时间上测定溶液的总荧光量，测定时要设对照，以消 除内源荧光强度；②测定酶反应不同时间溶液荧光量 （荧光法十分灵敏，微小的增加量也可以测定出来） ，在酶反应初始阶段，酶作用生成的荧光物质在反应 体系中处于积累阶段，荧光产物与时间有线性关系， 而内源性荧光物质的荧光量与时间无此种关系，因而 可通过测定酶反应初始阶段几个时间的荧光量，得到 的线性关系即可作为。