引物设计技巧及优化_生工生物技术讲座.pdf

PCR引物与探针设计引物与探针设计曹霞上海生工曹霞上海生工•目录目录背景背景1引物设计与分析的软件引物设计与分析的软件2DNA合成及常见问题合成及常见问题3引物设计及合成网址和邮箱引物设计及合成网址和邮箱4•背景背景 ?PCR原理?引物设计流程实验鉴定引物评估引物设计PCR类型确定基因序列查找Step by step?基因的查找基因的查找? 进入NCBI 主页：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/search 后面 选择Gene，在for 后面填写需要查找的基因的名字如图所示：?点击“Search”，出现以下界面：选择 gene输入基因名称基因的全称基因的物 种来源?点击序列1的DDR1出现页面如下图所示（部分页面）：?设计引物之前知道需要确定设计引物之前知道需要确定PCR类型类型?普通PCR ?SNP鉴定 ?Real-time PCR ?RT-PCR ?荧光定量探针荧光定量探针?引物的作用（基因获得、测序、检测等）引物的作用（基因获得、测序、检测等）?引物设计与分析软件引物设计与分析软件 ?引物设计软件• Primer 3 plus • Oligo 6.22• Premier 5.0• Primer Express 3?引物分析软件• Primer 5• Oligo 6.22• Primer-Blast?引物设计需考虑的问题引物设计需考虑的问题?引物长度: • 太短—低的特异性，结果可导致非特异性扩增。

• 太长—在退火时，可能导致与模板结合效率低，发卡结构 的发生 ?合适长度： • 18-24 bp适合普通PCR扩增 • 30-35 bp适合多重PCR扩增 ?产物大小： • 300-1000 bp适合普通PCR，避免> 3 kb • 50-150 bp适合real-time PCR，避免> 400 bp?引物设计需考虑的问题引物设计需考虑的问题? 序列Tm值:上下游引物的Tm值（melting temperature）是 寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50 %寡核 苷酸双链解链的温度有效启动温度，一般高于Tm值 5~10 ℃若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的 Tm值 ? 合适的Tm值： • 52 ℃ - 60 ℃ • 65 ℃以上避免 • 75 ℃ - 80 ℃来扩增高GC含量的片段 ? 上下游引物Tm值的错误： • 上下游引物Tm值错误，可能导致扩增失败 • 上下游引物Tm值相差最好 AA[ACACACACA]CGGATAGAAC}TTExcluded RegionTargetIncluded Region引物和探针选择区PCR产物大小Mg2+浓度dNTP浓度任何位置最大互补碱基数显示引物对数碱基重复数任何位置互补碱基数3'端互补碱基数两引物间任意互补碱基数两引物间3'端互补碱基数?荧光定量探针TaqMan ProbePrimerProbe与Primer的距离越近越好，PCR产物大小一般50-150 bp。

GC含量30-80%避免重复序列的出现，尤其4个以上G的出现Tm: 68-70（定量检测） 65-67（不同等位基因的检测）Tm: 58-60Probe 长度：13~25 bases (TaqMan MGB probe) 13~30 bases (TaqMan probe)20 bases（普通）避免连续6个A的出现3端5个碱基不能超出2个G+C5端第一个碱基不能为G选择C比G多的作为探针?进入进入Primer Express 3.0软件软件 ? 普通定量 • File→ New→ “TaqMan MGB Quantification TaqMan Quantification”→ OK可在”Sequence” Tab 中使用Copy & Paste粘贴或输 入序列列• 可勾选” Double Strand “, 即可显示double stranded DNA sequence• 在”Parameters” 中可看到Tab Primer/Probe Tm 值设定 Primers/Probe 设计规范• 回到”Sequence” TabTools → Find Primers/Probes 软件开 始寻找合适的Primers/Probe pairsPrimer Express找到备选引物和探针，一次搜索最多能找到50种组合。

• ”Sequence” Tab中会显示出”Primers / Probes” Tab相对应 的一对Primers/Probe:粉红色的是Probe的位置，蓝色上游引 物，黄色下游引物，如下图所示等位基因的检测 • 进入 Primer Express 3.0 软件 • File→ New→选择“TaqMan MGB Allelic 或Discrimination TaqMan Allelic Discrimination”→ OK建议使用 TaqMan MGB probe设计以达到更加效果• 标定SNP位置:将SNP位点，Edit → Annotate → “SNP Target ” 选择此SNP变异位点• Tools → Find Primers/Probes ，软件即开始查找合适的 Primers/Probes pairs• ”Sequence” Tab中会显示Primers / Probes” Tab 相对应的 Primers/Probes: 粉红色片段Probe 1，绿色片段 Probe 2的位 置(2个 Probe重叠的序列会呈现绿色)，蓝色Forward Primer ，黄色为 Reverse Primer。

引物评估引物评估• 用Blast软件进行同源性比较– 尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物– 选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引物– 选择两个引物3’端与同一非目的基因不同源的序列作为引物?引物同源性比较• Primer-BLAST • 界面?Oligo 6.22 介绍• 3个弹出窗口• 选中引物上游引物下游引物• 引物分析引物的主要信息二聚体形成分析发夹结构分析Tm与GC%对于此对引物的简短评价• Final PCR information?Primer Premier 5.0 介绍• 基本信息功能选择上下游引物• 引物编辑粘贴用Primer3Plus设计的引物分析编辑结果接受编辑结果返回到主窗口•DNA合成及常见问题合成及常见问题1保护基保护基:用三氯乙酸用三氯乙酸 (TCA) 脱去连结在脱去连结在 CPG 上的核苷酸 的保护基团上的核苷酸 的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲 基二甲氧基三苯甲 基)，获得游离的，获得游离的 5’-羟基端，以供下 一步缩合反应羟基端，以供下 一步缩合反应2活化活化:将亚磷酰胺保护 的核苷酸单体与四氮唑 活化剂混合并进入合成 柱，形成亚磷酰胺四唑 活性中间体将亚磷酰胺保护 的核苷酸单体与四氮唑 活化剂混合并进入合成 柱，形成亚磷酰胺四唑 活性中间体 (其其3’-端已 被活化，但端已 被活化，但5’-端仍受端仍受 DMT保护保护)，此中间体 将与，此中间体 将与GPG上的已脱保 护基的核苷酸发生缩合 反应。

上的已脱保 护基的核苷酸发生缩合 反应3连接连接 :亚磷酰胺四唑 活性中间体遇到亚磷酰胺四唑 活性中间体遇到 CPG上已脱保护基 的核苷酸时，将与 其上已脱保护基 的核苷酸时，将与 其5’-羟基发生亲合 反应，缩合并脱去 四唑，此时合成的 寡核苷酸链向前延 长一个碱基羟基发生亲合 反应，缩合并脱去 四唑，此时合成的 寡核苷酸链向前延 长一个碱基4封闭封闭 :缩合反应后， 为了防止连在缩合反应后， 为了防止连在CPG 上的未参与反应的上的未参与反应的 5’-羟基在随后的循 环反应中被延伸， 常通过乙酰化来封 闭此端羟基，一般 乙酰化试剂是用乙 酸酐和羟基在随后的循 环反应中被延伸， 常通过乙酰化来封 闭此端羟基，一般 乙酰化试剂是用乙 酸酐和N-甲基咪唑 等混合形成的甲基咪唑 等混合形成的5氧化氧化 :缩合反应时核 苷酸单体是通过亚 磷酯键与连在缩合反应时核 苷酸单体是通过亚 磷酯键与连在CPG 上的寡核苷酸连接， 而亚磷酯键不稳定， 易被酸、碱水解， 此时常用碘的四氢 呋喃溶液将亚磷酰 转化为磷酸三酯， 得到稳定的寡核苷 酸上的寡核苷酸连接， 而亚磷酯键不稳定， 易被酸、碱水解， 此时常用碘的四氢 呋喃溶液将亚磷酰 转化为磷酸三酯， 得到稳定的寡核苷 酸。

DNA合成?常见问题及解答常见问题及解答?怎样溶解引物？• 我们的的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L（ 即100 pmol/ul）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要 加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH>6.0）或TE缓冲液（ PH 7.5-8.0），开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000 转/分钟 的转速下离心1 分钟，防止开盖时引物散失合成的引物应如何保存?• 没有溶解的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年， 溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液，分装 数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反复多次 冻融会降低使用寿命）使用前，将浓溶液稀释成工作液 （10 pmol/ul或20 pmol/ul）后进行实验上海生工公司可以合成多长的序列？• 由于用户和基因拼接的要求，我们很好地合成过不少100 碱基左右长度的长片段因为我们可以提高起始合成数量 、加大合成用的试剂量、用PAGE纯化如果您的实验需 要，我们愿意接受110碱基以下的订单如何将两条互补的单链退火形成双链？• 用退火缓冲液(10 mM Tris, pH 7.5 - 8.0， 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合，总 体积不要超过500 微升，加热到95 ℃ 2 mins，然后缓慢冷 却至室温(低于30 ℃)即可。

退火的产物可以放在4 ℃待用 ?合成的引物5’端是否有磷酸化？• 合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团如果需要您可以用 多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接 在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费2OD的引物可以多少做次PCR反应？• 一般来讲，20个碱基左右的2OD的引物最少可以做400次 PCR反应引物在常温下运输，会降解吗？• 不会降解，干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上 而一般的运输时间通常都在1-3天，所以收到的引物不会 降解不同纯化方法的应用：产品用途纯化方法ULTRAHAPULTRAPAGEHPLC普通PCR√√多重PCR或定量PCR√√点突变或克隆√√基因合成√化学或物理应用√修饰或标记DNA√?适用网址http://www.bioinf ormatics.nl/cgibin /primer3plus/prim er3plus.cgi.设计与比对 引物网址http://www.ncbi.n lm.nih.gov/tools/ primerblast/index. cgi?LINK_LOC= BlastHomePrimer3PlusPrimer- Blast•引物设计及合成网址和邮箱引物设计及合成网址和邮箱?本公司免费设计引物提供材料模板序列或序列号模板序列或序列号模板物种模板物种PCR类型类型对引物的其他要求对引物的其他要求?生工引物合成及设计邮箱? 合成邮箱synth@? 引物免费设计邮箱Primer@。