WB实验原理.doc

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量原理1． SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小当蛋白质的分子量在15KD～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。

由此可见，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量2． Western 印迹在Western印迹法中，待测样品溶解于去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持物上（常用硝酸纤维素滤膜），然后可被染色随后滤膜可与抗靶蛋白的一抗反应最后，结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂（与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白）检测Western 印记法可测出1-5ng中等大小的待检蛋白方法1.    样品的制备从细胞中提取蛋白质样品用于Western印记的方法有两种，一是可以在加样缓冲液中直接溶解完整细胞；二是制备细胞提取液可根据不同的目的采用不同的方法如果仅是定性实验，可应用第一种方法；如果需测定蛋白含量并进行定量实验，可应用后一种方法1.1 凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品1） 裂解细胞或组织a.         单层培养细胞：用PBS缓冲液漂洗细胞2次，弃去洗液并吸尽残余的PBS液体，加入一定体积（50～200μl）的加热到85℃的1×SDS凝胶加样缓冲液[50mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 100mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 2% SDS, 0.1% 溴酚蓝，10%甘油] 溶解细胞，用细胞刮刀把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中，用于步骤2）。

b.         悬浮培养细胞：用冷的PBS充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷的悬浮缓冲液[0.1mol/L NaCl，0.01mol/L Tris.Cl（pH 7.6），0.001mol/L EDTA（pH 8.0），1μg/ml Aprotinin，100μg/ml PMSF]，涡流振荡混匀后，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液[100mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 4% SDS, 0.2% 溴酚蓝，20% 甘油]，混匀后，用于步骤2）c.         动物组织：用冷的PBS洗去残血后，加入一定体积用冰预冷的悬浮缓冲液，用剪刀剪碎，如有必要可在冰浴下匀浆，然后加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀后，用于步骤2）2） 将样品置于沸水浴中加热10分钟3） 室温下以10000rpm将样品离心10分钟，将上清移至一新管中，分装后，冻存于-20℃1.2 裂解缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品用于制备哺乳动物细胞蛋白质裂解缓冲液有多种，在对靶蛋白的抗原性一无所知的情况下，一般使用三去污剂和单去污剂裂解缓冲液，然后逐步过渡到更专门的提取方法。

三去污剂裂解缓冲液：50mmol/L Tris.Cl（pH 8.0），150mmol/L NaCl，0.02% 叠氮钠，0.1% SDS，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin，1% NP-40，0.5% 去氧胆酸钠单去污剂裂解缓冲液：50mmol/L Tris.Cl（pH 8.0），150mmol/L NaCl，0.02% 叠氮钠，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin，1% NP-40或Triton X-100高盐裂解缓冲液：50mmol/L HEPES（pH 7.0），500mmol/L NaCl， 100μg/ml PMSF，1% NP-40，1μg/ml Aprotinin无盐裂解缓冲液：50mmol/L HEPES（pH 7.0）， 100μg/ml PMSF，1% NP-40，1μg/ml Aprotinin1） 裂解细胞或组织a.     单层培养细胞：用冷PBS缓冲液漂洗细胞2次，弃取洗液并吸尽残余的PBS液体，加入一定体积（50～200μl）用冰预冷的裂解缓冲液，置于冰上孵育20分钟然后用细胞刮刀将细胞刮下，连同裂解缓冲液一起移至微量离心管中，用于步骤2）。

b.     悬浮培养细胞：用冷的PBS充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷的裂解缓冲液，重悬细胞，于冰上放置30分钟后，用于步骤2）d.         动物组织：用冷的PBS洗去残血后，加入一定体积用冰预冷的裂解缓冲液，用剪刀剪碎，如有必要可在冰浴下匀浆，用于步骤2）2）于4℃以12000rpm将裂解物离心2分钟3）将上清移至一新管中，分装后，冻存于-20℃电泳时取出适量的提取液（50μg）与等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液混合后，置于沸水浴中加热5分钟以使蛋白变性2．蛋白含量的测定（Bradford）2.1 所需试剂1）      0.15mol/L NaCl： NaCl 0.88g 水 100ml2）      0.5mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）：BSA 0.5mg 0.15mol/L NaCl 1ml3）      考马斯亮蓝溶液：在1L容量瓶中，将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml磷酸，然后补加水至容量瓶体积。

用滤纸过滤后，于4℃保存2.2 操作步骤1）  分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml BSA（ 1.0，2.5，5.0，10和20μl），以0.15mol/L NaCl补足体积至20μl，同时以两管20μl的0.15mol/L NaCl作空白对照2）  每管各加入480μl考马斯亮蓝溶液，振荡混匀，室温放置2分钟3）  用1cm光径的比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线4）  取待测样品2.5μl，补加0.15mol/L NaCl 17.5μl，480μl考马斯亮蓝溶液，混匀后，在A595下比色，从BSA标准曲线中确定待测样品的蛋白含量如果待测样品的浓度过高，可稀释后再测3． SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western 印迹3.1 所需试剂1）  30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺 29gN，N′-亚甲双丙烯酰胺 1g 水 100ml2）  10% SDS： SDS 10g水 100ml3）  1.5mol/L Tris（pH 8.8）：Tris 18.17g水 80ml 溶解后，用浓HCl调pH至8.8，补水至100ml，4℃保存。

4）  10% 过硫酸铵：过硫酸铵 0.1g水 1ml 4℃保存可使用一周5）  1.0 mol/L Tris（pH 6.8）：Tris 12.11g水 80ml 溶解后，用浓HCl调pH至6.8，补水至100ml，4℃保存6）  Tris-甘氨酸电泳缓冲液（25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸， 0.1% SDS）： Tris 3.02g 甘氨酸 18.8g 10% SDS 10ml 水至 1000ml7）  SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳12%分离胶所需溶液：水 3.3ml30%丙烯酰胺溶液 4.0ml 1.5mol/L Tris（pH 8.8） 2.5ml 10% SDS 0.1ml 10% 过硫酸铵 0.1ml TEMED 0.004ml8）  SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所需溶液：水 3.4ml30%丙烯酰胺溶液 0.83ml 1.0 mol/L Tris（pH 6.8） 0.63ml 10% SDS 0.05ml 10% 过硫酸铵 0.05ml TEMED 0.005ml9）  甲醇：冰醋酸固定液：甲醇 450ml 冰醋酸 450ml水 100ml10）0.25% 考马斯亮蓝R250染液：考马斯亮蓝R250 0.25g 甲醇：冰醋酸固定液 100ml11）转移缓冲液（48 mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037% SDS，20% 甲醇）： Tris 5.8g 甘氨酸 2.9g 10% SDS 3.7ml 甲醇 200ml水至 1000ml12）丽春红储存液： 丽春红S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 水至 100ml 使用时，用水稀释10倍。

13）封闭液[10mmol/L Tris.Cl（pH 7.5），150mmol/L NaCl，2% Tween 20，4% BSA]： 1mol/L Tris.Cl（pH 7.5） 1ml 1mol/L NaCl 15ml 20% Twee。