黄曲霉毒素的检测及防控.ppt

黄曲霉毒素的检测及防控Analysis and Control of Aflatoxins内 容l黄曲霉毒素的概述l黄曲霉毒素的国际限量要求l黄曲霉毒素的检测l黄曲霉毒素污染的预防和控制l山东局技术中心黄曲霉毒素实验室l输欧花生黄曲霉毒素实验室检测一、黄曲霉毒素概述l黄曲霉毒素的研究历史l黄曲霉毒素的毒理作用l黄曲霉毒素的产生l黄曲霉毒素的分布l黄曲霉毒素的化学性质研究历史l1960年, 英国10万只火鸡死亡事件揭开了人们对于黄曲霉毒素的认识与研究l火鸡的死亡与饲料中含有较高浓度的黄曲霉毒素有关l用这种饲料（花生粉）对动物进行急性毒理实验后，证明具有强毒性对大白鼠进行长期的慢性中毒实验后，成功地诱发了肝癌l对毒饲料进行提取，得到了黄曲霉毒素l在随后的几十年中，黄曲霉毒素得到了科学界的高度重视黄曲霉毒素的毒理作用 黄曲霉毒素是潜在的肝脏毒素当大剂量摄入这些毒素时可能是致命的亚致死剂量会导致慢性中毒，而低剂量的长期接触则会致癌，特别是导致肝癌通常，动物幼仔比成年动物更加容易遭受黄曲霉毒素的毒害 黄曲霉毒素引起了人们对健康最强烈的关注，是因为其广泛分布于一些食物诸如花生、坚果、牛奶、玉米中，同时也是人类潜在的致癌原。

黄曲霉毒素的产生l黄曲霉毒素主要由黄曲霉和寄生曲霉等在代谢过程中产生l黄曲霉毒素产生的条件：菌株的产毒能力、适宜的湿度（80%-90%相对湿度和基质的含水量）、温度（24-30度）、氧气（1%以上）、培养时间、机械损伤、昆虫损害等黄曲霉毒素的分布l黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2大多分布在农产品中，常见的有花生、玉米、棉籽、芝麻、杏仁、辣椒等l黄曲霉毒素M1分布在牛奶及奶制品中l在哺乳动物的肝脏与尿中发现了黄曲霉毒素P1和Q1黄曲霉毒素的化学性质l黄曲霉毒素是结果相近的一群衍生物化学结构式为二呋喃环和香豆素在紫外线下，黄曲霉毒素B1、B2发兰色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发绿色荧光l黄曲霉毒素的分解温度为237-299度，一般加热不能破坏其毒性l在有氧条件下，紫外线照射可去毒l难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中一般在中性及酸性溶液中较稳定，在强碱溶液下易分解黄曲霉黄曲霉毒素毒素 B B1 1同肝细胞同肝细胞DNADNA的鸟嘌的鸟嘌呤碱基结合，使得控制细胞呤碱基结合，使得控制细胞生长的基因代码发生错误，从而使生长的基因代码发生错误，从而使细胞生长失控，成为癌性肿瘤细胞生长失控，成为癌性肿瘤。

二、黄曲霉毒素的国际限量Codex花生(未加工): 黄曲霉毒素总量 15ppb牛奶: 黄曲霉毒素M1 0.5ppbEU黄曲霉毒素B1/总量花生、坚果、干果： 2/4ppb花生（进一步挑选等）：8/15ppb坚果、干果（进一步挑选）：5/10ppb谷物及加工产品：2/4ppb各种调味品：5/10ppb澳大利亚、新西兰l黄曲霉毒素总量：花生：15ppb美国l所有食品： 黄曲霉毒素总量 20ppb黄曲霉毒素的中国限量l玉米、花生、花生油、坚果等 B1不得超过20ppbl大米、其他食用油等B1不得超过10ppbl其它粮食（麦类、面粉、薯干）、发酵食品（酱油、醋等）、淀粉类制品（糕点、饼干、面包等） B1不得超过5ppbl牛奶及其制品中M1不得超过0.5ppb三、黄曲霉毒素的检测 黄曲霉毒素的检测，从广义上，包括：采样、制样和检测三个过程l黄曲霉毒素的检测一直是困扰世界各国的难题原因：不均匀分布；ppb水平检测程序analytical procedure采采 样样样品制备样品制备/ /分样分样分析检测分析检测采样 sampling目的：得到一个有代表性的样品困难：1）分布不均匀 2）ppb水平办法：尽量加大采样点和采样量，使货物的每个部位都有同等的机会被抽到。

均匀分布（如蛋白质） 不均匀分布（黄曲霉毒素） 所谓“ppb” 1，000，000，000中的1分子 32年中的1秒 地球至月球总距离中的40cm 22公斤沙子中的1粒 3.5车厢中的1粒玉米 检测误差 Errors in Analysis集装箱样品小样检测100%总误差88%采样误差10%制样误差2%检测误差Whitaker Dicken，1974针对卡车或拖车装载玉米的取样方式针对卡车或拖车装载玉米的取样方式:第一次取样的位点标记为第一次取样的位点标记为 “O”. 如果需要更多的样品，应在标记为如果需要更多的样品，应在标记为 “X”的位点再次取样的位点再次取样取样方式取样方式从卡车中的取样量从卡车中的取样量由于分布不均匀由于分布不均匀可能检测到的结果范围可能检测到的结果范围4.50 kg2.25 kg1.00 kg0.45 kg11.6 - 28.4 ppb 8.1 - 31.9 ppb 3.2 - 38.8 ppb 0 - 46.9 ppb* 95% confidence range一卡车玉米中有一卡车玉米中有20ppb黄曲霉毒素的污染黄曲霉毒素的污染样品制备 sample preparation目的：将样品充分粉碎、均质化，为下一步检测做准备办法：使用高效粉碎机，粉碎最终直径小于2mm制样误差约占总误差的10%分析检测 test提取extraction净化purification分析analysis分析程序 - 提取 使用甲醇使用甲醇/ /水或乙腈水或乙腈/ /水混合液萃取研磨样品水混合液萃取研磨样品使用搅拌机使用搅拌机(2-5 (2-5 Minutes)Minutes)或震荡仪或震荡仪(30-180 (30-180 Minutes)Minutes)震荡萃取液震荡萃取液. .样品液数量与溶剂数量存在最样品液数量与溶剂数量存在最 佳比例。

佳比例注意所使用的有毒溶剂对健康注意所使用的有毒溶剂对健康的损害及污染的损害及污染分析程序----净化l净化是指去除提取液中的杂质（如脂肪、蛋白质、色素等），以避免对黄曲霉毒素的检测造成干扰几种常用的净化方法免疫亲和柱 (IAC)净化固相萃取柱（SPE）净化液-液萃取其他黄曲霉毒素的分析方法快速筛选法： 荧光光度计法 ELISA法确证方法： HPLC-FLD法免疫亲和柱净化-荧光光度计法l原理：紫外线照射后，黄曲霉毒素能发射特征荧光l优点：l1、操作简便、安全l2、检测限小于2ppbl缺点：有假阳性的存在酶联免疫法l原理：利用抗原抗体反应并由酶催化底物产生颜色进行定量的分析方法l优点：l1、操作简便、成本较低 2、有些商品化的试剂盒检测限能达到1ppb 缺点：有假阳性的存在方法的选用l经过筛选方法检测的样品，可以继续通过基准方法进一步确证黄曲霉毒素的存在，并进行更加准确的定量检测四、黄曲霉毒素的预防与控制l预防 preventionl采样 sampling l样品制备 sample preparationl样品提取 extractionl测试需求评价 evaluation of testing requirementsl检测 testingl结果确证 result validationl文本化 documentationl供货方介入 supplier involvementl去毒 removal五、山东局技术中心生物毒素实验室介绍 1. A professional Mycotoxin laboratory. 一个专业化的官方实验室一个专业化的官方实验室 2. A long history to detect Aflatoxin. 检测黄曲霉毒素历史悠久检测黄曲霉毒素历史悠久& Introduction悠久的历史悠久的历史悠久的历史悠久的历史1.Use biology method since 1970s.2.Use TLC method since 1980s.3.Use HPLC method since 1990sHPLC-MS/MSCerealsMulti-mycotoxinBio-method / ELISASea foodsDSP/PSPHPLC-FLD/ELISACerealsT-2 toxinHPLC-FLDCorn, cerealsZearalenoneHPLC-UVCereals DeoxynivalenolHPLC-UVApple juicePatulinHPLC-FLDMilk, milk powderAflatoxin M1IAC/PCD/HPLC-FLDPeanut, corn, cerealsAflatoxinMethodCommodity Parameter & 生物毒素检测业务生物毒素检测业务&& 实验室认可实验室认可STCIQ is accredited by China national accreditation service for Conformity Assessment (CNAS) and operated in accordance with ISO/IEC 17025:2005 (E) General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.FAPAS 成绩时间Date轮次号FAPAS Series and RoundAFB1 z-scoreTotal AF z-score2001.11Series 4 Round 39-0.5-0.22002.10Series 4 Round 470.70.72003.7Series 4 Round 56-0.7-0.52004.9Series 4 Round 67-0.4-0.42005.8FAPAS 04790.80.92006.4FAPAS 04880.80.82007.7FAPAS 0410400Ø组织国内能力验证活动组织国内能力验证活动 1l时间时间 : 2002年年lAnalyse: 花生酱中的黄花生酱中的黄曲霉毒素曲霉毒素l组织者组织者: CCIBLAC l轮次轮次 : 国认实函国认实函[2001]17号号l参加实验室数参加实验室数 : 63 Ø 组织国内能力验证活动组织国内能力验证活动 2l时间时间 : 2005lAnalyse: 花生酱中的黄曲花生酱中的黄曲霉毒素霉毒素l组织者组织者: 国家食品安全国家食品安全局局lRound: 质检食函质检食函[2005]082号号l参加实验室数参加实验室数 : 15 Ø 组织国内能力验证活动组织国内能力验证活动 3l日期日期: 2005lAnalyse: Aflatoxin Analysis in Peanut pastel组织者组织者: 山东局山东局lRound: 鲁检便食字第鲁检便食字第077号号lAttended Laboratory Number : 52Ø 组织国内能力验证活动组织国内能力验证活动 4lDate: 2006(on going)lAnalyse: Aflatoxin Analysis in Peanut pastelSponsor: CNASlRound: CANS T0339lAttended Laboratory Number : 74Ø 组织国内能力验证活动组织国内能力验证活动 5lDate: 2006lAnalyse: Aflatoxin Analysis in Peanut pastelSponsor: 山东局山东局lRound:lAttended Laboratory Number : 89六 输欧花生黄曲霉毒素的实验室检测工作&& （黄曲霉毒素的检测流程）（黄曲霉毒素的检测流程）Flow chart of Aflatoxin analysisl 接样接样 Sample receive l 样品登记样品登记 Sample registerl 样品制备样品制备 Sample preparationl 净化净化 Sample clean upl 测定测定 Sample HPLC determinationl 报告报告 Reportl 留样、记录留样、记录 Reserve samples and records接样接样 (1)Is it sealed ?Is it clearly labelled ?Is it weigh about 30kg ?Sample receive (2)样品登记样品登记分分 样样Samples must be Thoroughly mixed before divided into three Sub-samples样品制备样品制备 、样品、样品均匀性测试均匀性测试Sample preparation 实验室样品、留存样品实验室样品、留存样品 Sample preparation record实验室前处理实验室前处理Sample Clean-up仪器测定仪器测定 HPLC Determination如何保证检测结果的准确？实验室质量控制1、样品制备过程： 定期进行样品均匀性核查2、实验室检测过程： 日常检测采用加标回收和质控样品 加标回收 质控样品3、每年参加国际间实验室能力验证活动检检 测测 报报 告告 的的 格格 式式 与与 解解 释释1、、 方法的检出限（方法的检出限（LOD））2、、方法的检测限（方法的检测限（LOQ））3、、 回收率（回收率（Recovery））4、、 不确定度（不确定度（ Uncertainty））报告中的检出限、检测限l针对GB/T 18979-2003方法l检出限是0.3ppb，检测限是1.0ppb 报告的三种情况： 未检出： 低于检出限〈 1.0 ppb ：检出了，但不能准确定量 实际值： 能准确定量 回 收 率l检测结果与真实值Recovery（100%）= 检测结果 / 真实值如何得到真实值？1）购买有证样品（质控样品）2）空白添加已知浓度的标样 （质控样品）将待测样品与质控样品同批检测，计算回收率。

报告中的回收率校准l样品1与质控样品（样品A）同批检测，样品A的实际值为2.0ppbl结果：样品1的检测结果为3.0ppb，样品A的检测结果为1.8ppbl回收率计算：1.8/2.0=90%l样品1的实际值为：3.0ppb/0.9=3.3ppb如何理解报告中的不确定度？l报告中：本方法的扩展不确定度 (在95%可信区间): B1为20%，总量为20%如何理解？l结果  不确定度（U）lU(B1)=0.20×B1“检测值” U(总量)=0.20×总量“检测值”l假设实际值：B1= 1.8ppb 1.8  1.8 ×20%=1.8  0.4 （1.4，2.2） 该样品中的黄曲霉毒素B1的最佳估计值是1.8ppb，它在1.4 - 2.2ppb的范围内Thank you ！。