分子生物学课14章.ppt

单击此处编辑母版标题样 式 单击此处编辑母版副标题样式 1 1 第14章 RNA的生物合成 转 录 转录 Transcription 以DNA为模板合成 RNA 的过程 14 1 转录的特点 以DNA为模板酶促合成RNA RNA聚合酶以双链DNA中的一条链 或单链DNA 为模板 按照A与U 或T与A G与C配对的原则 将4种核糖核苷酸 NTP 以3 5 磷酸二酯键的方式聚合起来 催化合成 与模板互补的RNA 被转录成单个RNA分子的一段DNA序列 称为一个转录单位 一般由启动子 promoter 结构基因 structural gene 终止子 terminator 三部分组成 3 5 5 结 构 基 因 pt 3 DNA双链中只有一条链被转录成RNA 实验证明 双链DNA中只有一条链作为模板转录合成RNA 负责转录合成RNA的DNA链叫模板链 template strand 另一条链叫编码链 coding strand 模板链与编码链 互补 模板链转录合成的RNA的碱基顺序与编码链的碱基顺序 完全一致 只是其中的T被U取代而已 转录的方向为5 3 模板链 编码链 5 5 5 3 14 2 原核生物基因的转录 原核生物基因的转录过程已基本研究清楚 共包括模板的识别 转录起始 延伸 终 止等4个步骤 1 原核生物的RNA聚合酶 1 RNA聚合酶的结构 全酶 2 含2拷贝 亚基 和 各一个 分子量大约500 000 亚基的作用仍不清楚 在大肠杆菌的RNA聚合酶中 因子与其它 部分的结合不是十分紧密 它易于与 2 分离 后者称为核心酶 细菌的RNA聚合酶全酶 2 500 kD 和 亚基 催化中心 构 成核酸通道 亚基 核心酶组装所需 也与调节因子作用 亚基 启动子识别 具有 启动子特异性 亚基 RNA聚合酶的核心酶结构 即从全酶中去掉 亚基 亚基基因分子量数目组分可能的功能 rpoA40 0002核心酶酶的连接 装配 rpoB155 0001核心酶与底物 核苷酸 结合 rpoC160 0001核心酶与模板结合 10 0001核心酶不详 70rpoD70 0001 因子 与启动子结合 识别模板 链 E coli RNA聚合酶的结构与功能 2 亚基 亚基在RNA合成的起始中具有关键作用 在生物进化过程中 形成了不同的 亚 基 不同的 亚基可以帮助RNA聚合酶识别不 同的启动子序列 细胞中不同状态RNA聚合 酶的数量 每个E coli细胞中含约 7000个RNA 聚合酶 核心酶主要以松散的闭 合复合体为主 足量的 亚基使三分之 一的聚合酶以全酶形式 存在 主要是在非特异 位点的松散复合体和启 动子处的紧密 开放 复合体 约2500个核心酶正在进 行转录 核心酶与DNA双链的作用比 较松散 结合半寿期约1 hr 核心酶不区分启动子和其他序 列 亚基加入后 全酶与松散结 合位点的结合力下降 半寿期 1 s 但与启动子结合可增强 1000倍 半寿期达几个小时 全酶与启动子结合常数基本反 映了启动子的强度 亚基与核心酶的解离 结合对 RNA聚合酶功能的影响 2 转录过程 1 启动子 promoter 启动子 RNA聚合酶识别 结合 并启动 转录的DNA序列 两组序列 Pribnow框 Pribnow box 又叫 10区 序列为 TATAAT Sexfama框 Sexfama box 又叫 35区 序列为 TTGACA 细菌启动子特征 1 起点通常是一个嘌呤 2 起点上游10 bp处 有一约6 bp的保守区域 称为 10 区 也叫Pribnow Box 共有序列为 T80 A95 T45 A60 A50 T96 3 起点上游35 bp处 有一约 6 bp的保守区 称为 35 区 共有序列为 T82 T84 G78 A65 C54 A45 4 90 的启动子中 10与 35区的距离在16 18bp之间 两个保守区之间的序列并不重要 但距离很关键 因子与启动子的结合 70的2 4区的氨基酸与启动子 10区 非模板链特异碱基的结合 RNA聚合酶对启 动子的识别可能有三 种方式 随机扩散 随机行走 定向取代 2 模板的识别 全酶 启动子形成闭合二重复合 体 闭合复合体转变为开放复合体 整合进最初两个核苷酸 形成一 个磷酸二酯键 形成三重复合体 在酶不需要移动时 即可加入9 个核苷酸 但在加入核苷酸过程 中 随时可能释放RNA 起始成功后 释放出 亚基 3 转录的起始 RNA聚合酶结合在DNA上时 其长度会发生变化 尺蠖模型 4 转录的延伸 转录过程中的模板 识别 起始与延伸 终止子 terminator 终止RNA合成反应 所需的DNA序列 在转录结束的位点 提供 终止信号 RNA合成的终止实际依赖于已转录的RNA序 列 终止发生有两种方式 5 转录的终止 不依赖于 因子的终止子 依赖 因子的终止 不依赖于 因子的终止子 intrinsic terminators 合成的RNA尾部的序列特 征 1 二重对称的序列形成 发卡结构 在发卡结构的 茎基部富含G C对 发卡结构可减缓或暂停合 成 2 尾部有约6个连续的U 连续的A U对使杂交链 更容易分离 依赖 因子的终止 因子 六聚体 每个亚基46kD 也称终止因子 具依赖RNA的ATP酶活性 在E coli中可结合于自由RNA链 并沿RNA链移动 序列特征 有一富含C而少G的序列 终止子序列 先结合于RNA链上 沿 RNA链移动 RNA聚合酶在终止子处 暂停 因子追上聚合酶并使 之解离 并拆分RNA DNA杂交链 3 原核生物RNA转录后的加工 1 mRNA的加工 原核生物转录生成的mRNA基本上不经加工即可进行蛋白 质的生物合成 翻译 事实上许多原核生物的mRNA是在转 录尚未完成之前就已开始翻译了 也就是说 转录与翻译是 偶联在一起的 许多转录生成的RNA需经加工后才能成为有功能的RNA分子 加工方式 剪接 剪切 加头加尾 修饰 rRNA的加工过程是以核糖体颗粒的形式进行的 即 rRNA前体合成后先与蛋白质结合 形成新生核糖体颗粒 而 后再经过一系列的加工过程 生成有功能的核糖体 在原核生物中 rRNA包括三种 即16S 23S和5S rRNA 在大肠杆菌中 这三种rRNA的基因形成一个转录单位 其 中还包含一个或多个tRNA基因 它们之间由间隔区分开 2 rRNA的加工 3 tRNA的加工 a 剪切 b 在3 端形成 CCA c tRNA中含有大量修饰成分 还要通过各种 不同的修饰酶进行修饰 才能成为成熟的tRNA 分子 14 3 真核生物RNA的转录过程 1 真核生物的RNA聚合酶 RNA聚合酶I 转录 rRNA RNA聚合酶II 转录 mRNA前体 HnRNA SnRNA RNA聚合酶III 转录 tRNA和5S rRNA 起始需要辅助因子 但随后不需要 与 原核生物相反 真核生物中由辅助因子识别 启动子 种类类 在细细胞 中的 位置 对对 鹅鹅膏蕈 碱的敏感 性 合成RNA 的种类类 RNA聚合 酶 I 核仁 不敏感10 3mol L 5 8S 18S 28S rRNA RNA聚合 酶 核质质 最敏感10 9 10 8mol L mRNA snRNA RNA聚合 酶 核质质 介于酶I和酶 II 10 5 10 4mol L tRNA 5S rRNA 真核生物RNA聚合酶的特性 2 真核生物的启动子 1 RNA聚合酶I 只有一种启动子 含两个结合位点 核心启动子 core promoter 45 20 上游控制元件 upstream control element UCE 180 107 帽子位点 即转录起始位点 碱 基大多为A TATA box 位于RNA聚合酶II 转录起点上游约 25 bp处的保 守的7碱基序列 绝大多数情况 下全部是A T碱基对 只有少数 含有G C CAAT box 起点上游 75附近 的小段保守序列 增强子 enhancer 可增强 启动子效率的序列 可位于启动 子上游或下游 可远距离作用 2 RNA聚合酶II启动子 TATA box T82A97T93A85 A83 CAAT box GG CAATCT RNA聚合酶 在转录时需要一些辅助蛋白质因子即转录 因子 transcription factor TF 这些因子和酶一起 构成一个转录结构 识别特定的启动子序列 激活型结构域 柔性连接 DNA 结合结构域 3 RNA聚合酶III的启动子 转录5S RNA tRNA 基因 5S RNA和tRNA的 启动子在转录起点 的下游 3 真核生物RNA转录后的加工 1 mRNA 首 尾 的修饰 5 末端三种 帽 的结构 3 末端多聚 A 尾 poly A 帽子结构 2 真核mRNA的剪接 3 真核rRNA转录后的加工 在真核细胞中有4种rRNA 即28S 18S 5 8S和5S rRNA rRNA是在核仁中合成的 前三者的基因组成一个 转录单位 在转录过程中先形成一个45S前体 然后 在核内经过一系列的加工过程 再转移到细胞质中 而 5S rRNA与tRNA一起由RNA聚合酶 转录 处在另一个转 录单位中 4 真核tRNA转录后的加工 切除tRNA前体两端多余的序列 这一过程是在特 异性酶的催化下完成的 末端的添加 即在3 末端添加 CCA序列 此一步 由tRNA核苷酰转移酶 tRNA nucleotidyl transferase 催化 修饰 tRNA修饰碱基很多 主要为甲基化修饰 占被修饰碱基的一半以上 还有其他一些方式的修饰 如碱基置换或转换等 14 4 催化活性RNA 核酶及其功能 四膜虫rRNA前体的自我剪接 L19 RNA以高度特异的方式催化寡聚核糖核苷酸的裂解和 联结反应 五胞核苷酸 C5 被L19 RNA转变为更长一些和更 短一些的寡聚体 具体地说 C5被降解为C4和C3 与此同时 又能生成C6和更长一些的聚合物 可见 L19 RNA既是一个 核糖核酸酶 又是下一个RNA聚合酶 现在把RNA性质的酶称为核酶 ribozyme 除了L19 RNA外还发现了一些其他的核酶 看来核酶更适合于识 别和催化单链的核酸分子 因为核酶和这类底物使用的 是共同的语言 碱基配对 核酶发现的生物学意义 核酶的发现使人们对于生命的起源有了新的认识 生命 的最初形式大概是RNA 最初的生命界可能是个RNA王国 因为RNA既可作为模板而复制繁殖 同时它又是催化剂 即 它兼有DNA和蛋白质二者的功能 然而在进化过程中 由于 作为模板而遗传的功能RNA不如双链DNA稳定 而作为催化 剂的功能它又不如蛋白质那样多样 所以作为遗传信息携 带者的功能它让位给DNA 作为催化剂的功能则大部分由蛋 白质所取代 RNA则仅保留了它作为信使和一部分催化作用 等功能 这就是目前生命界的实际情况 这种推断是否正 确还有待实验的证明 在应用方面 人们正在设计合成特异切割病毒RNA或其 它RNA的核酶 以便用以治疗包括艾滋病 癌症在内的疾病 虽然目前还没有成功应用的报道 但具有良好的发展前 景 。