qPCR 内参基因选择——【RT-PCR技术】.pdf

RT-PCR和qPCR实验内参基因选择 内参基因概念和作用 内参基因的选择 参考示例 目录 加入标题入标题加入标题 内参即为内部参照，内参基因则是在检测目的基因从DNA到 mRNA表达过程中可用来当作参照的基因内参基因通常是表 达稳定的管家基因 内参基因概念和作用 内 参 基 因 的 作 用 为了避免检测样本在为了避免检测样本在 RNA 产量、质量产量、质量 和反转录效率上可能存在的差异，校和反转录效率上可能存在的差异，校 正上样量，上样过程中存在的误差正上样量，上样过程中存在的误差 标准化作用标准化作用 校正作用校正作用 内参基因表达相对稳定，用来作为基内参基因表达相对稳定，用来作为基 因表达参照，反应基因表达水平的变因表达参照，反应基因表达水平的变 化 内参基因概念和作用 加入标题 2. 北京基因组所针对北京基因组所针对73种动物种动物 115种植物，对内参基因的选择种植物，对内参基因的选择 和使用进行总结：使用最多的内和使用进行总结：使用最多的内 参基因是：参基因是：EF1，，ACTN，， Ubqultin，，GAPDH，，18S rRNA 题 1. 推荐网站：推荐网站： 内参基因概念和作用 内参基因的选择 1 1) ). .在组织和细胞中在组织和细胞中表达量相对较高表达量相对较高 2)2). .稳定表达于不同类型的细胞和组织稳定表达于不同类型的细胞和组织 3)3). .表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关 4)4). .不受任何内源性或外源性因素的影响不受任何内源性或外源性因素的影响 1.1.内参基因选择标准内参基因选择标准 5)5). .不存在假基因，以避免基因组不存在假基因，以避免基因组 DNA DNA 的污染扩增的污染扩增 内参基因的选择 2.2.常用的内参基因常用的内参基因 1 1).).常用的内参基因主要有管家基因常用的内参基因主要有管家基因actinactin，，GAPDHGAPDH，，18S 18S rRNArRNA 2)2). .三种模型及疾病中常用的内参基因，如表所示三种模型及疾病中常用的内参基因，如表所示 内参基因GAPDH GAPDHGAPDH：甘油醛：甘油醛- -3 3- -磷酸脱氢酶，是磷酸脱氢酶，是糖酵解糖酵解反应中的一个关键酶反应中的一个关键酶, ,为管家基因，为管家基因， 几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般 是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒 定，被广泛用作内参。

定，被广泛用作内参 内参基因内参基因GAPDHGAPDH应用及注意事项应用及注意事项 内参基因GAPDH 涉及代谢及涉及代谢及ATP合成和消耗，合成和消耗，GAPDH一般不能用，此外在特定环境及组织下一般不能用，此外在特定环境及组织下 如缺氧，骨骼肌（如缺氧，骨骼肌（肌肉组织肌肉组织）等）等GAPDH 不适合作不适合作mRNA为内参 Actin Actin 是是是横纹肌肌纤维中的一种主要的蛋白成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主是横纹肌肌纤维中的一种主要的蛋白成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主 要成分，要成分，存在于所有的真核细胞中并且高度保守存在于所有的真核细胞中并且高度保守ActinActin基因具有组织特异性基因具有组织特异性 内参基因Actin 内参基因内参基因ActinActin选择和注意事项选择和注意事项 1).1).研究模型是心肌，骨骼肌或者平滑肌研究模型是心肌，骨骼肌或者平滑肌 ( (这些组织有特异的这些组织有特异的actin)actin) 2).2).肌肉组织肌肉组织 ( (由于肌肉组织中由于肌肉组织中- -actinactin分布很少，不易检测分布很少，不易检测) ) 3).3).在缺氧条件（哮喘）下，在缺氧条件（哮喘）下，- -actinactin表达不稳定表达不稳定 4).4).某些特殊组织（某些特殊组织（T T和和B B淋巴细胞，血液），淋巴细胞，血液），- -actinactin不适合作内参不适合作内参 内参基因Actin rRNArRNA的合成是由的合成是由RNARNA聚合酶聚合酶I I合成，而合成，而mRNAmRNA是由是由RNARNA聚合酶聚合酶IIII合成，因此合成，因此 18S18S和和28S 28S rRNArRNA合成的调节独立于合成的调节独立于mRNAmRNA，在影响，在影响mRNAmRNA表达的各种条件下，表达的各种条件下， 18S18S和和28S 28S rRNArRNA水平很少发生变化，常用作内参基因。

水平很少发生变化，常用作内参基因 内参基因18S rRNA 内参基因18S rRNA 18S 18S rRNArRNA内参基因的应用和注意事项内参基因的应用和注意事项 2).2).结构上结构上18S18S和和28S 28S rRNArRNA不包括不包括poly(A)poly(A)尾，随机引物尾，随机引物oligooligo( (dTdT) )在在 cDNAcDNA合成中不能被逆转录，需要自带特异引物反转录合成中不能被逆转录，需要自带特异引物反转录 1).18S1).18S和和28S 28S rRNArRNA由于在纯化过程中被去除而不能用于标准化分析由于在纯化过程中被去除而不能用于标准化分析 3). 3). rRNArRNA常用作常用作mRNAmRNA检测的内参基因，如检测的内参基因，如RTRT- -PCRPCR，，qPCRqPCR，，Northern Northern bolttingboltting，不用做蛋白内参，不用做蛋白内参 内参基因使用示例 文献文献1 材料：材料： 1. TP31：恶性黑色素肿瘤细胞培养系 2. UVM：正常黑色素瘤细胞培养系 3. Tumors: 患者黑色素肿瘤细胞 本文研究过程中肿瘤组织和肿瘤细胞系本文研究过程中肿瘤组织和肿瘤细胞系RTRT- -PCRPCR都使用都使用18s 18s rRNArRNA为内参，为内参，WesternWestern使用使用- - actinactin作为内参作为内参 内参基因使用示例 乳腺癌转乳腺癌转BPIBPI基因研究中，基因研究中，qPCRqPCR选择了选择了18S 18S rRNArRNA作内参，而作内参，而Western blotWestern blot选择了选择了GAPDHGAPDH为为 内参内参 文献文献2 材料：材料： 1.乳腺癌细胞系 2. 转染了BPI基因的 乳腺癌细胞系 内参基因使用示例 小鼠结肠癌表皮生长因子下调小鼠结肠癌表皮生长因子下调miRNAmiRNA的研究中，的研究中，qPCRqPCR和和weaternweatern都选择都选择- -actinactin作为内参作为内参 基因基因 文献文献3 材料： 1. 人结肠癌组织 2. 人正常结肠粘膜组织 3. EGFR敲除和野生小鼠 内参基因选择和使用总结 1.1.18S rRNA广泛用于广泛用于mRNA检测内参，但需反转录引物，一般不用做检测内参，但需反转录引物，一般不用做western内参内参 2. -actin作为作为mRNA检测内参基因的范围比较广泛检测内参基因的范围比较广泛(除心肌，骨骼肌，平滑肌，特定肿瘤除心肌，骨骼肌，平滑肌，特定肿瘤 和组织之外和组织之外)；广泛用做；广泛用做western内参内参 3. GAPDH由于受代谢及影响因素较多，一般不用由于受代谢及影响因素较多，一般不用mRNA检测内参；检测内参；广泛用做广泛用做western内参内参 4. 肿瘤细胞一般不用肿瘤细胞一般不用GAPDH和和-actin作为作为mRNA表达内参，表达内参，18S rRNA更适合肿瘤细胞更适合肿瘤细胞 mRNA内参内参基因基因 5.5.此外，此外，肝组织研究肝组织研究,发现发现UBC（泛素）和（泛素）和HMBS（胆色素原脱氨酶）对于肝组织的表达分（胆色素原脱氨酶）对于肝组织的表达分 析是最佳析是最佳mRNA内参；内参；在白血病、正常、恶性肿瘤中比较在白血病、正常、恶性肿瘤中比较-actin、、2-MG和和PBGD （胆色（胆色 素原脱氨酶），发现素原脱氨酶），发现2-MG最合适作为最合适作为mRNA内参。

内参PRKG1和和TBP是适合于在是适合于在B和和T细胞及细胞及 其肿瘤中控制其肿瘤中控制RNA的质量和产量的质量和产量 内参基因选择和使用 参考文献及网页：参考文献及网页： 1. 董恩妮, 梁青, 李利,等. 实时荧光定量PCR内参基因的选择J. 中国畜牧杂志, 2013, 49(11):92-96. 2. 3.Prasad N B, Somervell H, Tufano R P, et al. Identification of genes differentially expressed in benign versus malignant thyroid tumorsJ. Clinical Cancer Research, 2008, 14(11):3327-3337. 4. Yang J, Mani S A, Donaher J L, et al. Twist, a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis.J. Cell, 2015, 117(7):927-939. 5. Xu H, Bionaz M, Sloboda D M, et al. The dilution effect and the importance of selecting the right internal control genes for RT-qPCR: a paradigmatic approach in fetal sheepJ. Bmc Research Notes, 2015, 8(1):1-15. 6. Felder E, Wlfel R. Development of a versatile and stable internal control system for RT-qPCR assaysJ. Journal of Virological Methods, 2014, 208:33-40. 7.Haas M J, Plazarte M, Chamseddin A, et al. Inhibition of hepatic apolipoprotein AI gene expression by histamineJ. European journal of pharmacology, 2018, 823: 49-57. 内参基因使用总结 RTRT- -PCRPCR和和qPCRqPCRWestern blotWestern blot GAPDHGAPDH 涉及代谢及涉及代谢及ATPATP合成和消耗，在组织下如合成和消耗，在组织下如 缺氧，骨骼肌（缺氧，骨骼肌（肌肉组织肌肉组织）等情况）等情况GAPDH GAPDH 不适合作不适合作mRNAmRNA为内参为内参 涉及代谢及涉及代谢及ATPATP合成和消耗，在组织下如缺氧，合成和消耗，在组织下如缺氧，B B细细 胞胞和和T T细胞细胞，，血浆，组织液血浆，组织液及及部分部分肿瘤中肿瘤中不用作内不用作内 参。

参膜蛋白，多组织和多细胞水平膜蛋白，多组织和多细胞水平western western ，适，适 合选择合选择GAPDHGAPDH作为内参作为内参 ActinActin 除了特殊组织心肌，肌肉，除了特殊组织心肌，肌肉，T T和和B B淋巴细胞，淋巴细胞， 以及缺氧等环境，都适用作为内参以及缺氧等环境，都适用作为内参 除了心肌，肌肉等模型。