高效液相色谱仪 2010821
53页1、高 效 液 相 色 谱,2010/8/21,一、高效液相色谱仪,Agilent 1100,Waters 2487,借助气相色谱的理论演变,二、高效液相色谱法的特点,经典的柱色谱,高效液相色谱的模块,20世纪70年代后发展迅速,它在技术上采用高压泵,高效固定相和高灵敏度的检测器,实现了分析速度快,分离效率高和操作自动化。 特点:高压、高效、高速 分离对象:适用高沸点、热不稳定有机及生化试样分离分析 (与GC区分),三、流程及主要部件,流程,2. 主要部件,(1) 高压输液泵,单元泵,双 元 泵,高压泵作用:输送流动相。 也即是贮液瓶中的有机溶剂或缓冲溶液靠高压泵送入色谱柱。由于色谱柱的阻力很大,高压泵必须克服阻力以恒定流速输送流动相,这是保证色谱仪精确度的前提。 常用的压力范围:150350105 Pa 欧美等国家习惯使用psi作单位 PSI英文全称为Pounds per square inch。 定义为英镑/平方英寸, 它们之间的换算关系为: 1bar14.5psi =105Pa , 145psi = 1Mpa 1psi = 6.895kPa=0.06895bar,高压泵应具有以下性能
2、 流量稳定,精度在1%左右 输出压力高,通常2030MPa,最高50 MPa 流量范围宽,一般在0.0110mL/min范围内 能抗溶剂腐蚀 压力波动小、更换溶剂方便、容易清洗、具梯度洗脱 操作方便、容易维修,根据泵的操作原理不同,分为恒压泵和恒流泵 气动放大泵(恒压泵) 往复泵(恒流泵)是目前液相色谱使用最普遍的一种 高 压泵。其中又分单头往复泵和双头往复泵。 往复泵的优点是泵头内腔体积小,容易洗净,故更换 溶剂十分方便,尤其适合做色谱条件试验时使用。,气动放大泵,往复柱塞泵,(2) 进样装置 手动进样阀通常使用耐高压的六通阀 (美国Rheodyne 公司专利技术), 其结构如图所示:,进样装置 (正面),进样装置 (背面),图中a为进样阀处于“装样load”位置的情况,此时流动相直接进入色谱柱, 样品注入口与样品环连接,用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品 注入口注入,装于样品管内。当将扳手扳至“进样inject”位时,进样阀的 流路发生了改变,流动相通过样品管,将注入的样品带入色谱柱进行分析。 六通进样阀具有使用方便,进样量准确等优点。,样品环(Loop) 规格:有10L、20
3、L、50L等不同容积, 可以根据需要选配。 作用:用来贮液,也用来测量样品溶液的体积。 将样品环装满后进样,进样量即为样品环的容积,此种进样方式称为“满环进样”或“定量环进样”。 用定量环进样精密度好,在使用外标法时,应使用此种操作方式。,自动进样器,色谱柱是高效液相色谱的心脏,在HPLC的使用中, 保持色谱柱的柱效,延长柱子的使用寿命非常重要。,(3) 色谱柱,色谱柱流速方向,色谱柱的参数,色谱柱(Column) 结构:柱管多用不锈钢制成,色谱柱两端的柱接头内装有 筛板,目的是防止填料漏出。 填料:多以硅胶为基质,适用PH 28 粒度多为0.220 m(以510m居多) 。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 规格:常规分析柱(常量柱) 内径25mm(常用4.6mm, 3.9mm),柱长1030cm (15cm,25cm居多) 制备柱 (21.2mm、30mm、50mm) 半制备柱(5mm,7.8mm、9.8mm、10mm),C18柱(C8柱),主要是由于修饰到硅胶上的硅烷化 试剂不同。 C8是修饰的带8个碳原子的硅烷, C18是修饰的带18个碳原子的硅烷。,C18较C8极性小
4、,C18更适合分析中等到小极性的化合物, C8更适合中等偏大极性 化合物。,C18柱(C8柱)性能影响因素,正相柱:固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团,如胺基(NH2)和 氰基(CN)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基 团极性较强,因此,分离的次序是依据样品中各组分的极性大小,即 极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱;正相色谱使用的流动相极性相 对比固定相低,如正已烷、氯仿 、二氯甲烷等。 反相柱:固定相通常是以硅胶为基质,表面键合有极性相对较弱官能团的 键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强,通常为水、缓冲液与甲 醇,乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被 冲洗出,而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填 料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。,正相柱和反相柱,预柱和保护柱,从泵来的流动相,预柱,进样口,保护柱,分析柱,检 测 器,预柱是针对流动相来保护色谱柱 保护柱是针对样品来保护色谱柱,precolumn预柱,guard column保护柱 安装位置不同:预柱是泵后进样口前,
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