干细胞培养与鉴定

1、产品经理：施真,解析：干细胞的培养与鉴定,主要内容,1. 干细胞原代提取及鉴定 2.干细胞培养体系与操作细节的重要性 3.OricellTM系列干细胞产品及售后服务,2,原代培养过程,3,原代取材,组织来源（个体年龄、健康状况） BMSC、ADSC：成人（18-45周岁）、大鼠和小鼠（4周龄）、兔和狗（1-3 周龄） NSC：大鼠（孕龄14.5天的胚胎）；小鼠（孕龄12.5天的胚胎） ESC：小鼠（见栓后3.5天的孕鼠） 取材部位 BMSC：髂骨或胸骨、后肢股骨和胫骨 ADSC：抽脂手术的脂肪组织或腹股沟 NSC：胚胎大脑GE区 ESC：囊胚内细胞团,4,5,间质干细胞（MSC）,定义：来源于中胚层的早期细胞， 能够分化为多种中胚层和神经外胚层来源的细胞。 来源组织：骨髓、骨膜、脂肪组织、脐血等。 来源物种：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、猪等。,6,广泛存在于成年或胚胎哺乳动物大脑内 可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。,神经干细胞（NSC）,7,胚胎干细胞(embryonicstemcellES, 细胞)是指胚泡期的内细胞团中分离出的尚未分化的、能在体外培养、具有发育全能性

2、的早期胚胎细胞 无限增殖、自我更新 可分化为三个胚层来源的各种组织及细胞类型,胚胎干细胞（ESC）,分离细胞,分离方法的选择 BMSC：密度梯度离心法（人、猴、狗） 贴壁筛选法（大鼠、小鼠、兔） ADSC：胶原酶消化法 NSC：无血清培养基自然筛选法 ESC：囊胚内细胞团迁移法,8,密度梯度离心法,密度梯度离心法：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 试剂： Ficoll淋巴细胞分离液，分离出密度在1.0770.001g/L之间的淋巴细胞,9,用 1xPBS 按照 1：1 的比例稀释骨髓； 稀释后的骨髓沿离心管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上； 离心； 离心完毕，小心吸取中间云雾状单个核细胞层； 离心，加入培养基重悬接种； 3天之后首次换液； 其后，每隔2-3天换液； 待细胞到80%融合的时候进行传代。,10,密度梯度离心法,11,取大鼠/小鼠的后肢股骨和胫骨； 用1mL注射器吸入培养基后冲洗骨髓腔，将骨髓全部冲洗出来； 骨髓悬液进行离心； 弃上清，用培养基重悬细胞，接种到1个T25或者T75培养瓶中； 3天后换液，以

3、后每隔2-3天换液，待细胞80-90融合时传代。,贴壁筛选法,扩增传代,传代时机的控制（MSC为例） 细胞汇合度的判断 传代消化时间的控制 接种密度的控制 培养体系的选择,12,扩增传代-细胞汇合度的判断(MSC),13,扩增传代-消化时间的控制(MSC),14,细胞消化15s,细胞消化35s,细胞消化55s,不同物种、细胞类型之间接种密度有差异 MSC、ADSC：2104/cm24104/cm2 NSC：1.0-2.0105cells/mL ESC：1104/cm22104/cm2,15,扩增传代-接种密度的控制,纯化鉴定,16,纯化方法：多次传代进行纯化 常规检测：细菌、真菌检测；支原体检测；内毒素检测； 鉴定检测：增殖能力、生长形态、特异性抗原表达、核型分析、诱导分化能力等,常规检测,17,鉴定检测共通项目,复苏存活率 台盼蓝拒染法-如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。,18,鉴定检测共通项目,19,细胞倍增时间：生长曲线测定（计数法或者CCK8法),细胞倍增的时间区间即细胞对数生长期，细胞传

4、代、实验等多应在此区间进行。可在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间，即倍增时间。,形态学 表面抗原标记 多向分化能力,20,MSC（间质干细胞）鉴定检测,MSC（间质干细胞）鉴定检测,形态学:梭形、成纤维样细胞 原代：克隆样生长 传代后：均质、旋涡状排列,21,Human,Dog,Monkey,Mouse,Rat,Rabbit,MSC（间质干细胞）鉴定检测,表面抗原标记（流式鉴定）： MSCs属混杂细胞群，其表面抗原也具有非专一性, 它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，如粘附因子、生长因子和细胞因子受体以及整合素家族等。,22,MSC（间质干细胞）鉴定检测,23,MSC（间质干细胞）鉴定检测,诱导分化能力鉴定：成骨诱导（茜素红染色）,24,诱导前（汇合度65%-70%）,染色前,成骨诱导,25,MSC（间质干细胞）鉴定检测,诱导分化能力鉴定：成脂诱导（油红O染色）,26,诱导前（融合度90-95%）,成脂染色前,诱导分化能力鉴定：成软骨诱导（阿利新蓝染色、三维培养法）,27,MSC（间质干细胞）鉴定检测,染色前,石蜡切片后染色图片,形态学特征：可做悬浮培养或

5、贴壁培养 特异性抗原表达：Nestin 分化能力：神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞,28,NSC（神经干细胞）鉴定检测,29,大鼠神经干细胞-悬浮培养,大鼠神经干细胞-贴壁培养,小鼠神经干细胞-贴壁培养,小鼠神经干细胞-悬浮培养,NSC（神经干细胞）鉴定检测-形态学,30,NSC（神经干细胞）鉴定检测,特异性抗原表达 Nestin (神经干细胞标志物)阳性表达率75% 3-tubulin（神经元标志物）阳性表达率 10% GFAP (星形胶质细胞标志物)阳性表达率10% GalC或OSP（少突胶质细胞标志物）阳性表达率10%,31,NSC（神经干细胞）鉴定检测,Rat NSC nestin staining,Mouse NSC nestin staining,分化能力 自然分化 加入含血清培养液，继续培养约7天，可分化为神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞。三者的分化比例约为(167)%， (757)%和( 53)%。 定向分化 1.神经元方向分化：用无血清无生长因子诱导液诱导，可使分化比例升至60%以上。 2.少突胶质细胞分化：加入T3或insulin可使分化比例大大提高。,32,N

6、SC（神经干细胞）鉴定检测,33,神经元方向分化（Tubulin Staining),星型胶质细胞方向分化（GFAP Staining),Rat NSC,NSC（神经干细胞）鉴定检测,34,少突胶质细胞方向分化（OSP Staining）,NSC（神经干细胞）鉴定检测,形态学：集落样或克隆样生长 特异性转录因子/抗原表达：表达OCT-4，Nanog；SSEA种属间表达有差异 染色体结构：传代过程中保持正常稳定的核型 全能性：具有向胚胎的三个胚层来源的所有细胞分化的能力,35,ESC（胚胎干细胞）鉴定检测,36,小鼠ES：紧密牢固结合、多层密集立体生长，呈堆积状，边缘清楚，细胞核大、核仁明显、核浆比高。,人ES：相对松散、扁平状集落,集落内细胞界限隐约可见,ESC（胚胎干细胞）鉴定检测-形态学,有MEF,无MEF，无血清培养体系,特异性表达,37,ESC（胚胎干细胞）鉴定检测,染色体结构 核型分析：正常稳定的二倍体核型，小鼠（40， XX/ XY) 。 不随传代次数而改变。,38,ESC（胚胎干细胞）鉴定检测,39,小鼠ES核型分析：40，XY,ESC（胚胎干细胞）鉴定检测,核型分析：显

7、色技术,全能性 体内分化：畸胎瘤实验 体外分化：EB（拟胚体）形成实验,40,ESC（胚胎干细胞）鉴定检测,体内分化,41,将细胞注射入（约106个）SCID（重症联合免疫缺陷）或裸鼠体内，约4周后（人ES可能需要810周），可见细胞注射处有肿块生成，处死小鼠，肿瘤固定后做石蜡包埋，切片，普通HE染色后观察。 ES可在小鼠体内生长、分化、形成含有三个胚层来源的良性畸胎瘤。,ESC（胚胎干细胞）鉴定检测,体外分化,42,ES,EB,贴壁诱导,约57天后出现自主性搏动,ESC（胚胎干细胞）鉴定检测,43,刚接触干细胞，不知道该用什么培养基？ 费尽心血提取的干细胞养了几代就老化了？ 原代取材杂细胞太多？ 细胞生长不均匀，有的地方密有的地方稀？ 操作其他细胞都没问题，养干细胞就出现了污染？ .,干细胞培养体系与操作细节的重要性,44,干细胞的研究和利用过程中，最主要的提供最适生长环境，保持培养开始时细胞群体的状态，这就要求培养条件始终如一，近乎呆板地坚守细节和常规。,培养体系的选择,干细胞饲养员必备素质-细节决定成败,无菌意识，重中之重 规范化的无菌操作 超净台取用物品摆放、操作时细节问题 环

8、境的控制 培养箱的定期消毒、水浴锅定期换水、大环境的控制等 生物试剂使用前仔细阅读产品说明书 操作干细胞时动作轻柔 复苏、传代、冻存等步骤重悬细胞的过程 培养基使用前复温、细胞接种之后摇匀、各种干细胞接种密度的控制、试剂保存时避免反复冻融等,45,46,干细胞,细胞培养耗材、分子耗材,培养基,细胞因子,冻存液,OricellTM系列干细胞产品及售后服务,干细胞相关试剂及耗材,47,OricellTM系列无蛋白非程序冻存液,48,49,细胞培养耗材的选择 干细胞培养板、培养瓶 （特殊TC处理表面，更适用于干细胞的贴壁培养） 神经元/神经干细胞培养板 （多肽包被，无需PLL/Laminin预处理，保存时间长） 15ml、50ml离心管 （透明度更高、耐更高转速） 分子生物学耗材（ Labcon系列） 全美进口55周年历史FDA/USP认证 吸头 微量离心管 PCR产品系列 储样管、储样架等,OricellTM系列耗材,Cyagen团队特别针对免疫细胞、干细胞培养开发的一系列SCTSTM高活性细胞因子产品，拥有高活性、高纯度、高稳定性、无热源、无外源因子污染等特点，更适合干细胞、再生医学、免疫学等研究使用。 常见治疗用细胞因子：IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、GM-CSF、IFN-、TNF-,50,细胞治疗用细胞因子,产品售后服务内容,51,售后技术支持服务,52,贴心咨询服务,53,54,完善的售后质量保障服务,

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