植物组织培养幻灯片1

1、植物组织培养,主讲人：韩春梅（博士、副教授） 1998-2002，内蒙古民族大学/学士 2002-2005，四川农业大学/硕士 2005-2008，中科院成都生物研究所/博士,第一章 绪 论 植物组织培养 的基础理论和基本知识,Tissue Culture,一、植物组织培养的基本概念和分类 （一）植物组织培养的概念 1、植物组织培养又称为植物无菌培养（离体培养、试管培养），指在无菌条件下，将植物的离体器官（根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（花药、胚珠、形成层、皮层、胚乳等）、细胞（体细胞、生殖细胞等）以及原生质体，放在离体无菌条件下，在人工控制的环境条件下，培养在人工配制的培养基上对其进行克隆，使其生长、分化并长成完整小植株的过程。,A Glimpse of Plant Tissue Culture,2、植物组织培养的分类： 根据培养的器官不同，分为花药培养、胚珠培养、根培养、茎尖培养、叶培养等； 根据培养基的形态（培养方式），分为固体培养（在培养基内加入琼脂）和液体培养（也叫液体震荡培养或悬浮培养）两种；,根据培养物量的多少，分为大量培养、微量培养； 根据培养过程是否需要光照，分

2、为光培养、暗培养； 根据培养方法不同，分为平板培养、微室培养、悬浮培养、单细胞培养等。,补充：悬浮培养又分为振荡培养、旋转培养和纸桥培养 振荡培养：在培养过程中，将培养基和被培养器官、组织、细胞放入振荡器中振荡而完成的培养过程。主要应用于组织培养和细胞培养。,旋转培养：在培养过程中，将培养基和被培养器官、组织、细胞放入摇床旋转而完成的培养过程。主要应用于器官脱分化培养。 纸桥培养：在培养过程中，将培养基中放入滤纸，再将材料置于滤纸上而进行的培养过程。主要应用于植物脱毒茎尖培养。,（二） 植物组织培养的生理依据,1、植物细胞的全能性 指植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力，细胞的这种特性叫细胞全能性。 2、细胞具有这种潜能是因为每个细胞都包含了这个物种的所特有的全套遗传物质，具有发育成为完整个体所必需的全部基因。,3、植物生长调节物质是植物组织培养中的关键性物质：IAA（诱导愈伤组织形成、诱导生根）、CTK（诱导生芽）、GA（促进已分化芽的伸长生长）、ABA、ETH等，用量极少。,补充： 脱分化：指植物的根、茎、叶、花、果实、种子等器官在人工条件下

3、失去原有的状态和功能，恢复到能分裂和增殖细胞的状态（愈伤组织或细胞团）的过程。 再分化：指细胞状态（愈伤组织）再次分化产生分生组织，形成器官状态（丛生芽或胚状体）的过程。,外植体：在植物组织培养过程中，由植物体上切取的根、茎、叶、花、果、种子等器官以及各种组织和细胞统称为外植体。（大多为多细胞体，均具有分化器官或其他组织的能力）。 愈伤组织：离体的植物器官、组织或细胞，在培养一段时间以后，通过细胞分裂，形成一种高度液泡化、无定形状态、由薄壁细胞组成的排列疏松的组织。,愈伤组织 （Callus）,植物组织培养过程,再分化,脱分化,愈伤组织,外植体,试管苗,新植株,CTK、IAA,培养基,无菌环境下操作,（三）植物组织培养的类型,1、愈伤组织培养： 愈伤组织（外植体） 体细胞胚胎发生（体细胞胚） 再生植株 愈伤组织（外植体） 器官发生途径（不定根/芽） 再生植株,愈伤组织分化的方向,2、器官培养：根、茎、叶、花、果实、种子等均可。 3、胚培养： 拯救胚：避免受精后胚乳发育不良或因种胚与胚乳间不亲和而致使杂种胚夭折，及时分离幼胚接种在无激素培养基上使之直接成苗。,4、细胞和原生质体培养：在组

4、织培养过程中，对单个分离出来的细胞或去掉细胞壁而裸露的原生质体进行培养。 原生质体：指去掉细胞壁的由质膜包裹着的具有生活力的裸露细胞（细胞膜、细胞质、细胞核）。,二、植物组织培养的发展,探索阶段（1902-1929年） 组培方法和定义的建立阶段（1930-1939年） 细胞全能性的证实阶段（1940-1959） 组培技术和理论迅速发展阶段（1960-1979） 组培技术在生产上广泛应用阶段（1980-至今）,1. 探索阶段（1902-1929年）,Haberlandt（德国植物生理学家）：,观点：,贡献：,提出细胞全能性,小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和万年青属表皮细胞,无分裂,细胞高度分化+培养基中无生长激素,首次进行离体细胞培养,高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞,Knop+蔗糖,1904年：Hanning胚培养：培养萝卜和辣根菜的胚，得到植株；,1922年：Kotte和Robbins根培养；,1925年：Laibach亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种。,其它研究,1922年：Knudson采用胚培养法获得兰花幼苗，克服其种子发芽困难的问题；,2. 组培方法和定义的建立阶段（1930-

5、1939年）,1934年：White 用番茄根建立第一个植物无性系。 当根2 cm长 切成0.5-1 cm切断，无菌液体培养 完全相同的离体根 根离体培养真正成功。 并提出植物细胞全能性假设： 1934年：Gautherete培养山毛杨、黑杨形成层组织产生了愈伤组织；,1937年：White发现3种B族维生素和IAA对植物生 长有用 1939年：Gautherete培养胡萝卜根小外植体成功 1939年：White培养烟草种间杂种幼茎切段原形成 层成功 1939年：Nobecourt培养胡萝卜根块茎薄壁组织成功,组织培养的奠基人,3. 细胞全能性的证实阶段（1940-1959）,1943年：White植物组织培养手册A Handbook of Plant Tissue Culture，标志组织培养成为一门新兴学科； 1946年：罗士韦在菟丝子茎尖培养地观察到花的形成，为试管受精奠定了基础；,1948年：Skoog和崔真培养烟草茎段时，发现腺嘌呤或腺苷可解除生长素对芽生长的抑制作用，腺嘌呤/生长素高，生芽；低，生根；相等，不分化。 1952-1953年：美国科学家Steward F.C.用

6、胡萝卜根的细胞悬浮培养，发现单个细胞能象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完整植株。证实了植物细胞全能性学说。,1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获得无病毒大丽花植株。 1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。 1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin / 生长素,4. 组培技术和理论迅速发展阶段（1960-1979）,1960年以来组织培养理论、实践、技术和方法不断完善和发展，形成独具特色的专业技术 在实验技术上建立了较完整的实验程序，已成为一种重要和精细的实验技术 组织培养已广泛应用于生物学的许多分支学科，并取得丰硕的成果。,4.1原生质体培养,1960年：Cocking酶解法分离原生质体获得成功。使植物细胞可以象动物细胞一样进行细胞融合。 1971年：日本 takebe和Nagata首次利用烟草叶片分离原生质体并获得再生植株。 80年代的一个研究热点,日本和中国做出了很大的贡献。,日本科学家进行了大约70个植物品种的原生质体培养。 中国获得了30个以

7、上品种的原生质体再生植株，其中包括难度较大的重要粮食作物和经济作物大豆、水稻、玉米、小麦、谷子、高梁、大麦、棉花、油莱、马铃薯等。 在木本植物、药用植物、蔬菜和真菌原生质体培养方面的进展也十分迅速。,4.2 细胞融合与体细胞杂交 1972年，美国Carlson诱导粉蓝烟草和郎氏烟草的原生质体融合得到种间体细胞杂种：第一株体细胞杂种。 1978年，有性杂交不亲和的番茄/马铃薯间的体细胞杂交获得了杂种植株（Melchers）。随后获得了地上结番茄，地下生马铃薯的杂种植物。,1985年，马铃薯的栽培品种与野生种的体细胞杂交，得到了抗晚疫病和卷叶病的体细胞杂种（Austin）。 科间的大豆/粉蓝烟草（Kao，1977）、大豆/烟草（Chien，1982）产生了连续增殖的杂种细胞系，更远缘的大豆/水稻产生了愈伤组织（Niizeki，1985）。,4.3 胚胎培养和试管受精 避免受精后胚乳发育不良或因种胚与胚乳间不亲和而致使杂种胚夭折，及时分离幼胚接种在无激素培养基上使之直接成苗，这就是胚挽救。 大大提高远缘杂交的成功率。主要应用于一些亚洲国家。大量的幼胚培养成为植株的报道，有40多个杂种胚培养成

8、功。 印度科学家在裁培种菜豆、黄麻和花生的远缘杂交中获得了理想的重组体。 中国农科院蔬菜所培养结球甘蓝和大白菜的杂种胚得到了种间杂种。,4.4 组织及细胞培养生产有用物质 Arregnin和bonner在1950年首先进行了培养橡胶茎愈伤组织获取橡胶的尝试。 1967年，Kaul和Staba从牙签草的组织和细胞培养物中分离出目的次生代谢物呋喃色酮。 近50年来飞速的发展。从400多种植物培养细胞中分离到600多种次级代谢产物，其中60多种在含量上超过或等于其原植物，20种以上干重超过1。,在日本，人参细胞培养已达130600 L发酵罐；德国用1000 L发酵罐培养毛地黄细胞；在我国，人参细胞培养技术也已实现产业化。 利用培养细胞的生物转化能力生产高值化合物，德国科学家进行了出色的研究。他们在毛地黄细胞的培养中加入生物合成途径的中间化合物毛地黄毒素和甲基毛地黄毒素，培养细胞以几乎 100的转化速率使之羟基化，变为医药强心剂地高辛。,4.5 单倍体育种 亚太地区一直处于领先的地位。 1964年，印度的Guba和Meheshiwari培养毛叶曼陀罗花药获得了第一棵单倍体植株。 印度培育的水稻

9、品系比对照提高产量15%49%；韩国获得了2个水稻新品种；日本培育了耐寒性和口味较好的水稻品种。,中国于1970年开始这方面的研究，取得了很大的成果。 40种以上植物获得单倍体植株，其中小麦、玉米、橡胶树、杨树、辣椒、油菜、柑桔、甘蔗、大豆、葡萄和苹果等的单倍体植株为我国首创。通过单倍体育种获得了水稻、小麦、烟草、辣椒和甜樱新品种。中华8号、9号等15个水稻新品种，总种植面积达1000万亩。 通过花粉和花药培养已获得了几百种植物的单倍体植株。,5. 组织培养在生产上广泛应用阶段（1980年-至今） 植物快速繁殖技术 60年代，法国的Morel用茎尖培养的方法大量繁殖兰花获得成功。植物快速繁殖技术、试管苗工厂化生产和无病毒种苗生产技术在70年代得到了快速的发展。,通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力的植物已有100多科、1000种以上。种类由以观赏植物为主逐渐发展到果树、林木、蔬菜和大田作物（粮食经济作物）。 美国、法国、意大利、荷兰等欧美国家试管苗的年产量均在数千万株以上，并且以每年7-8的速度增加。 我国快速繁殖和无病毒种苗生产的研究始于70年代，脱毒马铃薯、大蒜、香蕉、甘蔗、花卉等已开始规模化生产。,（一）植物组织培养的快速繁殖,三、植物组织培养的应用,快速繁殖主要应用于工厂化大规模生产的热带水果（香蕉、甘蔗、草莓等）、花卉（康乃馨、兰花）、树木（桉树）、珍惜植物（安徽黄里软子石榴、太和樱桃）等。,（二）脱毒 柑橘的衰退病、葡萄的扇叶病、草莓的病毒病、番木瓜的叶环斑病、马铃薯疫病、枣疯病、姜腐烂病等蔬菜，严重影响其产量和品质；花卉（康乃馨、菊花、百合、风信子等的鳞茎、球茎、宿根类花卉、兰科植物）退化严重，降低其观赏价值； 利用植物的茎尖培养脱毒技术可以克服病毒的感染。,（三）体细胞无性系变异和新品种培育 1、变异的无方向性 2、变异的普遍性 3、植物体细胞无性系变异的类型（遗传型变异和生理型变异） 4、引起植物体细胞无性系变异的原因（激素的种类和浓度） 5、植物体细胞无性系变异的利用价值及途径,（四）单倍体育种 （五）种质保存：名特优新品种、濒危物种 （六）遗传转化 （七）良种繁育 无

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