微生物学实验指导-根瘤菌质粒的快速检测‘
12页1、实验十二,根瘤菌质粒的快速检测,根瘤菌质粒的快速检测,目的要求 实验材料 实验程序 思考题,目的要求,了解根瘤菌质粒的有关特性 学习并掌握根瘤菌质粒的快速检测方法,实验材料,PA液体培养基: 蛋白胨4g、MgSO47H2O 5g、dH2O(蒸馏水)1000mL、pH 6.87.0。 TY固体培养基: 胰蛋白胨5g、酵母粉3g、CaCl26H2O 1.3g、dH2O 1000mL、pH7.0。 10 X TBE电泳缓冲液: Tris108g、H3BO3 55g、EDTA 9.3g、dH2O 1000mL、pH 8.3。 Tris-蔗糖溶液: 蔗糖25g、0.025mol L-1Tris-HCl(pH8.0)100mL、高压灭菌后40C保存。 RNA酶缓冲液: Tris-HCl( pH7.5)10m mol、NaCl 15 m mol、高压灭菌后40C保存。,实验材料,RNA酶溶液:RNA酶(Ribonuclease A,Sigma公司产品)4mg、 RNA酶缓冲液10mL、分装于小管中,1000C水浴中处理15min以灭活DNA酶,-200C保存。 溶菌酶溶液:溶菌酶(Lysoxyme,
2、Sigma公司产品)100mg、灭菌双蒸水(d2H2o)5mL、分装于小管中,每管50L,-200C保存。 裂解液(临用前配制): Tris-蔗糖1mL(用后归于40C)、溶菌酶溶液(20mg/mL)50L、 RNA酶溶液(400 g/ mL)50L、溴酚蓝指示剂12滴。,实验材料,溴酚蓝指示剂:溴酚蓝0.25g、蔗糖40g、 dH2O 100 mL、配后存于40C备用。 10%SDS:SDS10g、 dH2O 100 mL。 SDS琼脂糖凝胶:0.65%琼脂糖凝胶2mL、 10%SDS 0.35mL、1XTBE 1.15mL、溴酚蓝指示剂1滴。 溴化乙锭染色剂:溴化乙锭100mg、 dH2O 100 Ml。避光保存,因溴化乙锭是诱变剂,配制时要带手套,避免与皮肤接触。,实验程序,琼脂糖凝胶的制备 根瘤菌质粒DNA的制备 电泳及观察,实验程序 (琼脂糖凝胶的制备),用70%酒精擦洗电泳胶板、挡板、隔板及梳子。 用夹子将隔板及梳子夹住,平放在电泳胶板上。注意隔板及梳子的底端要齐,并且梳子的底部与胶板的间距约0.5mm,同时下好挡板。 配制0.65%的琼脂糖-TBE胶,在微波炉上熔化摇匀,
3、冷却至650C左右倒在胶板上。倒胶之前先用琼脂糖胶封住电泳胶板的四周,以免漏胶。 配制3.5mL的SDS琼脂糖凝胶,熔化后于650C水浴中保存备用。 待凝胶完全冷却后,小心地取出隔板,再将SDS凝胶注满由隔板形成的凹槽。 待SDS胶冷却后,小心地拔出梳子,放入电泳槽中,准备点样。,实验程序 (根瘤菌质粒DNA的制备),将待测的根瘤菌在TY固体培养基上活化。 将活化后的菌株接种于5mLPA液体培养基中,与 280C振荡培养过夜,直至对数生长中期(菌数约为104 个/mL) 取1mL菌悬液至1.5mL的小离心管中离心,弃去上清液并用滤纸条尽量吸去多余的液体,置于冰上30min。 加入新鲜配制的裂解液约50L(视菌体多少而定),搅匀后用点样器点入点样槽内,一般每槽点样为2030 L。,实验程序 (电泳及观察),接通电源,使点样槽位于负极,先20V低电压电泳30min,然后升高到100V电泳6h。电泳过程中应注意观察溴酚蓝指示剂的电泳位置及情况。 关闭电源,取出电泳胶板,将凝胶放在含0.5g/mL溴化乙锭的染色剂中染1530min,再转入蒸馏水中脱色1530min。 将脱色后的凝胶放在暗室中的紫外透射仪上观察结果,并注意戴好防护面罩。,思 考 题,如何区分染色体DNA与质粒DNA? 正常情况下,实验应出现怎样的结果?,实验十二,结 束,
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