运动性疲劳对大鼠心肌细胞钙浓度的影响及人参皂苷单体Rb1对心肌保护作用的研究

1、摘要运动性疲劳指机体不能将它的机能保持在某特定水平，或者不能维持某一预定的运动强度【1 】。运动性疲劳对心脏功能影响研究虽然有报道，但其影响作用及机制仍然不清楚，尤其是在分子细胞水平上对心肌细胞内【c a 2 + 】i 的研究没有报道，因此本论文通过游泳训练制备运动性疲劳大鼠模型，检测心肌细胞钙离子浓度的变化，探讨运动性疲劳对心脏功能的影响。本文研究了心肌细胞内【c a 2 + 】i 变化的规律，血液生化，心电，心肌力学相关指标的变化及人参皂苷单体R b l 对心肌的保护作用，这对人们的健康及长期疲劳心肌钙水平调控控制范围具有重要的理论意义和现实意义。通过连续1 5 天，每天3 小时的游泳耐力运动建立大鼠运动性疲劳模型，大鼠疲劳时游泳水淹过鼻，且经常下沉应用自动生化分析仪器测定血浆乳酸脱氢酶，肌酸磷酸激酶，葡萄糖，C a 2 + 变化。应用P o w e rL a b 测定标I I 导联心电图( E C G ) ，在体左心室收缩压，左室舒张末期压，室内最大升降速率，心率。为了排除神经和体液因素的影响，应用L a n g e n d o r f f 离体灌流测定左心室收缩压，左室舒张末期

2、压，室内最大升降速率，心率。并在细胞水平上应用绝对钙离子成像技术测定了心肌细胞 c a 2 气。运动性疲劳可使大鼠血浆C K 由对照组的3 5 7 8 3 5 0 4 5 I U L 显著上升至5 5 8 1 1 0 1 2 I U L ( P R e R e R h l R 1 R 9 2 R b 3 。而实验中R 9 3 ，R d 和R h 2 则是作为氧化强化剂而起作用的。R g l 在抗氧化特性上没表现出任何协同关系。T s a iS C 等1 2 I 】研究了人参皂苷单体R b l 类似促性腺激素的作用。从机制和机理上探索了人参皂营R b l 对黄体激素分泌的影响。发现在未经任何处理的大鼠和O r e h 大鼠中人参皂苷R b l 并没有改变血浆中黄体激素的水平，在1 0 分钟的游泳运动结束后血浆中黄体激素的浓度明显的升高了。与生理盐水对照组相比较，人参皂苷R b l 导致由促性腺激素释放激素改变或是游泳运动引起睾丸激素水平降低。在半垂体组织中和进一步用二氢睾酮离散的垂体细胞中，人参皂苷R b l 剂量依赖性的增加了黄体激素的释放，表明人参皂苷R b l 通过直接作用于大鼠垂

3、体细胞而增加黄体激素的分泌。W a n gL C ，L e eT F 2 2 的研究发现人参皂苷处理明显的增加了在运动过程中大鼠血浆自由脂肪酸的浓度，同时维持葡萄糖浓度在一恒定水平。表明人参皂苷在后续的运动中通过改变供能物质的动态平衡而增加运动的耐力，可能是由于在细胞的能源需求中增加自由脂肪酸的利用优于对葡萄糖的利用。进一步的研究发现R 9 1 和R b l 均为人参皂苷增强有氧运动耐力起作用的关键成分。上述研究说明人参皂苷对运动机能可产生影响，围绕人参皂苷做抗疲劳研究定能取得满意的成果。现在有很多报道己深入到人参的主要活性成分人参皂苷在脂质膜上，免疫器官以及心血管上的作用进行研究报道。但关于人参皂苷抗疲劳的研究报道却甚少，更没有关于人参二醇组皂苷单体R b l 抗疲劳的相关报道。1 2 研究意义及目的运动性疲劳是一种非常复杂且涉及面极广的现象。运动疲劳的研究已经有很长的历史，根据研究的情况看运动性疲劳在人体中可分为躯体性疲劳和心理性疲劳，目前在躯体性疲劳方面研究成果较多。但能被人们接受的有以下的几种区分方法：根据疲劳产生的部位不同，将运动性疲劳划分为中枢疲劳、神经一肌肉接点疲劳和外周

4、疲劳；根据疲劳发生时间的长短不同，将运动性疲劳划分为急性疲劳和慢性疲劳；根据疲劳发生性质的不同，将其划分为生理性疲劳和病理性疲劳；根据疲劳发生部位的大小，将其划分为全身性疲劳和局部性疲劳。运动医学界对此进行了广泛而深入的研究，但对引起疲劳的原因和机理，在运动生理学上目前还没有完全取得一致的看法，仍众说纷纭。当前对运动性疲劳的研究主要集中于神经、肌肉、内分泌、免疫和细胞代谢及其调节的研究。从心血管方面来看，运动过程中心脏提供的血流量己满足不了工作肌肉对氧和营养物质及运走过多代谢产物的需求可引起运动性疲劳。对于运动性疲劳对心脏的影响，对心肌细胞的损伤研究较少。研究运动性疲劳对心功能的影响及对心肌结构的改变将为保护运动性疲劳导致的心肌损伤具有积极的意义，将为增进人民健康有着十分重要的理论价值、实践意义和社会效益。本文通过游泳耐力训练建立运动性疲劳大鼠模型，主要研究了运动性疲劳对心功能的影响。对血浆肌酸磷酸激酶( C K ) ，乳酸脱氢酶( L D H ) ，葡萄糖( G l u ) ，C a 2 + 进行测定；对运动性疲劳大鼠模型心脏进行表观测量观察；对运动性疲劳大鼠进行心电( E C G

5、) ，在体和离体心肌力学指标测定；分离大鼠心肌细胞应用离子成像技术进行C a 2+ 浓度测定，用以探讨运动性疲劳对心脏功能和心肌组织结构的影响。并运用人参二醇组皂苷单体R b l 对抗运动性疲劳，检验人参皂苷单体R b l 的抗疲劳效果。本研究将为运动性疲劳对心脏产生的负面效果提供理论支持，为对抗运动性疲劳，保护心肌提供理论支持，为开发人参皂苷单体R b l 为主要成分的抗疲劳保健品提供理论支持。62 实验材料与方法2 1 实验动物7 2 只健康成年W i s m r 大鼠，雌雄不拘，体重2 0 0 2 5 0 9 ，购自吉林大学基础医学院实验动物中心。实验室笼舍饲养，自由水食。2 2 药品与试剂人参皂苷单体R b l ：分子式：C 5 4 H 9 2 0 2 3 H 2 0 ，分子量9 5 4 ，由吉林大学基础医学院有机化学教研室提供。维拉帕米( V a r a p a m i l ) ：上海禾丰制药有限公司，分子量4 7 4 。氨基甲酸乙酯：分子式：N H 2 C O O C 2 H 3 ，分子量8 9 0 9 ，中国医药公司上海化学试剂公司生产。肝素钠( H e p a r i

6、nS a d i u m ) ：购自北京鼎国生物技术有限责任公司。F u r a - 2 a M ：2 一 6 一双乙酸基一5 一 2 一双乙酸氨基 一5 一甲苯氨乙氧基 一2 一苯骈呋喃基一5 一恶唑酸五钾盐乙酰酸甲基脂( C 也，0 2 N 3 = 1 0 0 1 - 8 6 ) ，购自美国S i g m a 公司。F u r a - 2C a l c i u mI m a g i n gC a l i b r a t i o nK i t ：绝对钙离子成像，钙离子浓度定标试剂盒，购自美国i n v i t r o g e n 公司。2 3 主要溶液配制K H 灌流液( K r e b s - H e m c l c i t 液)N a C l K aC a C l 2K H 2 t 0 4M g S 0 4 ( 7 H 2 0 1 N a H C 0 3G u c , o s eE D T A含c a 2 + 台氏液 N a C l K aC a a ，M g C h 6 1 L - 0 N a H ，P O 2 啪H e p e s6 9 2 9 L0 3 5e y e 0 2

7、 8 扎 n 1 6 以 0 2 9 扎2 1g e l2 0 9 L0 1 8 6g e l8 3 6 5 5 9 LO 柏2 3 9 ，L0 1 9 9 8 9 L0 m 1 7 9 C L0 0 3 9 9 L1 1 9 1 5 9 L室)K a ( K r a f tB r u h e ) 液K O HL 一谷氨酸K C l牛磺酸K I - 1 2 P 0 4M s C h 。6 H 2 0葡萄糖H e p e sE G l A2 4 实验仪器2 4 1 血液生化指标测定S i g r n a l 一1 5 K 高速冷冻离心机，德国( 东北师范大学生命科学学院分子遗传学实验麦迪卡1 6 8 7 2 N a K C I 离子自动分析仪，美国( 东北师范大学附属医院)日立7 0 6 0 全自动生化分析仪，日本( 东北师范大学附属医院)2 4 2 心电图及在体心肌力学指标测定P o w e r L a b 八导生理机能实验系统，澳大利亚A D i n s t r u m e n t s 。2 4 3 离伽0 肌力学指标测定L a n g e n d o r f f 离体心脏灌流系统B

8、 L 4 2 0 E + 生物机能实验系统，成都泰蒙科技有限公司。2 4 4 心肌细胞钙离子浓度测定L a n g e n d o r f f 离体灌流系统N i k o nT E 2 0 0 0 S 荧光倒置显微镜日本N i k o nP h o t o m e t r i c sC o o lC C D 摄像头英国S u R e rL a m b d aD G 4 超高速激发光波长切换器美国S u R e r 公司M e t a M o r p h 和M e t a F l o u r 图像分析系统2 5 实验方法2 5 1 运动性疲劳模型制备健康成年W i s t a r 大鼠，雌雄不拘，体重2 0 0 2 5 0 9 。于大桶内游泳致疲劳。游泳水深约4 2 c m ，水温3 0 2 ，每次三小时，前十天每天一次，后五天每天两次。若在游泳过程中，动物过于疲劳，不足以继续进行游泳则将其捞出休息1 0 分钟后继续游泳。依据文献资料以以下状态作为疲劳标准： ( 1 ) 运动性疲劳的开始阶段：水从大鼠耳下淹到耳上，身体轻度下沉。 ( 2 ) 疲劳的发展阶段：水淹过大鼠眼，其身体进一步下沉

9、时。 ( 3 ) 疲劳的力竭阶段：水淹过大鼠鼻尖，身体下沉无力返回水面时。 2 5 2 血液生化指标测定制备抗凝管：配制1 0 0 0 U m l 肝素，取4 0 U 加入1 5 r r d 离心管于3 7 烘箱烘干备用。采血：大鼠在麻醉状态下，经颈动脉手术插管采血于抗凝管内。8蛳眦一眦一一一于5 ，3 0 0 0 r r a i n 离心1 5 r a i n 分离血浆，将血浆小心吸出，冻存，送东北师范大学校医院检验科检测血浆乳酸脱氢酶( L D H ) ，肌酸磷酸激酶( c K ) 活性，血浆葡萄糖( G l u ) ，钙离子( C a 2 + ) 浓度。2 。5 3 心脏表观变化观察将动物断髓处死，开胸取出心脏，用刻度尺测量心脏的大小。吸去心脏表面水分，用天平测定心脏重量。2 5 4 心肌力学及心电图测定2 5 4 1 在体心肌力学及心电图测定给予氨基甲酸乙酯( 2 0 水溶液) 1 S g C k g 体重腹腔注射麻醉。给予1 5 0 0 U k g 体重肝素。应用P o w e r L a b 生物电放大器测定标导心电，对心电图R 波，S T 段T 波幅值进行测量分析。颈部手术剥离右侧颈动脉，插入心室插管，经右侧颈动脉插至心室，连接P o w e r L a b生物机能实验系统测定心肌力学指标：左室收缩压( L V S P ，l e f tv e n t r i c u l a rs y s t o l i cp r e s s u r e ) ，左室舒张末期压( L V E D P ，l e f t v e n t r i c u l a r d i a s t o l i c p r e s s u r e ) 室内最大升降速率( _ + d P d t ，m a x u m a lr i s e a n d d e c l i n er a t e o f v e n t r i c u l a r p r e s s u r e ) ，心率( H R ，h e a r tr a t e ) 。2 5 4

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