hTERT启动子调控hNIS和hTPO基因联合转染胶质瘤细胞介导放射性碘治疗的研究
194页1、天津医科大学博士学位论文hTERT启动子调控hNIS和hTPO基因联合转染胶质瘤细胞介导放射 性碘治疗的研究姓名:王澎申请学位级别:博士专业:影像医学与核医学指导教师:谭建20100501天津医科大学博士学位论文中文摘要研究背景与目的基因治疗技术是当前肿瘤研究中的热点,但面临着如何提高治疗基因的疗效和解决其靶向性表达的问题,而放射性碘对分化型甲状腺癌细胞则具有着高效、特异性的杀伤效果,其摄碘和贮碘的分子基础在于细胞膜上存在着人钠碘转运体( h N I S ) 和人甲状腺过氧化物酶( h T P O ) 。因此,本研究拟构建并应用重组腺病毒作为基因转移载体,将h N I S 和h T P O基因联合转染入胶质瘤细胞,评估转染后细胞的摄碘能力,以及放射性碘在细胞内的代谢动力学变化,并进一步评价放射性碘对胶质瘤细胞的杀伤效果。同时在腺病毒载体中引入人端粒酶逆转录酶( h T E I 玎) 启动子,通过实验分析其靶向性引导h N I S 在胶质瘤细胞中特异性表达的作用。方法1 、使用R T - P C R 和荧光定量P C R 检测多种肿瘤及正常细胞中的h T E R T 表达活性;通过P C
2、 R 及p M D 1 8 T 质粒载体对h T E R T 核心启动子进行扩增和克隆;以p G L 3 一B a s i c 为载体构建含h T E R T 启动子和h N I S 基因的重组质粒,并通过荧光素酶活性实验检测h T E R T 启动子在不同细胞中的启动效率2 、应用A d e a s y 系统构建含目的基因的重组腺病毒载体,并对病毒进行滴度测定和转染细胞后表达产物的鉴定。3 、使用重组腺病毒A d h T E R T - h N I S 单独转染,及与A d C M V - h T P O 联合转染胶质瘤细胞U 2 5 1 年1 1 U 8 7 ,确定最适感染复数;进行摄I 实验、晒I 内、外流实验分析放射性碘在胶质瘤细胞内的代谢动力学变化;通过N a C l 0 4 抑制实验和有机化测定实验验证h N I S 和h T P O 的作用;并进行克隆形成实验评估放射性b 1 I 对不同转染组的细胞的杀伤效果。争士申当日木l 、R T - P C R 的结果显示在H 4 6 0 、U 2 5 1 、U 8 7 、A R O 及F R O 等细胞中均存在h T E R Tm
3、 R N A 的表达,只是活性的高低不一;而在正常细胞M R C 5 中无表达。荧光定量P C R 的结果显示在胶质瘤细胞U 2 5 1 和U 8 7 内存在h T E R T 的高活性表达,与内参基因1 3 - a c t i n 对照,其相对含量分别为O 1 8 和0 1 2 。天津医科大学博士学位论文2 、成功构建并鉴定了含3 种不同长度h T E R T 启动子序列( 2 6 0b p 、4 5 6b p 及1 4 5 3b p ) 的p M D 1 8 T 和p G L 3 重组质粒,并成功构建并鉴定了含2 6 0b ph T E R T 启动子及h N I S 基因的重组质粒p O L 3 h N I S 。3 、荧光素酶活性实验结果显示,在上述肿瘤细胞中,3 种h T E R T 启动子片段均可诱导荧光蛋白的表达,但其启动效率存在差异,其q b p G L 3 2 0 4 中的启动子片段( 2 6 0b p ) 在F R O 、H 4 6 0 和U 2 5 1 中启动效率最强,可以达至U S V 4 0 启动子的8 0 。4 、构建并纯化了重组腺病毒A d C M V -
4、 h T P O ,空斑形成实验测定其滴度约为1 OX1 0 9p f u m l ,感染2 9 3 细胞后行W e s t e r nb l o t 结果显示在11 0k D 处可见阳性反应条带,为表达的h T P O 目的蛋白。5 、摄碘实验结果显示,单独转染组( A d h T E R T - h N I S ) 的胶质瘤细胞U 2 5 1 和U 8 7 均具有了较强的摄碘能力,分别提高了3 0 7 6 倍和2 9 6 6 倍;而联合转染组( A d h T E R T - h N I S A d C M V - h T P O ) 的摄碘能力又均有轻度增高,分别为3 5 5 5倍和3 2 8 8 倍。6 、坨5 I 的内、外流实验显示单独转染组的胶质瘤细胞能够快速的摄碘,峰值均出现在约4 0m i n 时;但碘的流出也较迅速,T e 约为1 1 1 2m i n ;而联合转染组则可以在一定程度上延缓眩5 I 的外流,T e 约为1 8 2 0m i n 。7 、过氯酸盐抑制实验结果显示,不同浓度的N a C l 0 4 均可抑制转染后胶质瘤细胞对1 2 5 I 的摄取,抑制率约
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