hTERT启动子调控hNIS和hTPO基因联合转染胶质瘤细胞介导放射性碘治疗的研究

天津医科大学博士学位论文hTERT启动子调控hNIS和hTPO基因联合转染胶质瘤细胞介导放射 性碘治疗的研究姓名：王澎申请学位级别：博士专业：影像医学与核医学指导教师：谭建20100501天津医科大学博士学位论文中文摘要研究背景与目的基因治疗技术是当前肿瘤研究中的热点，但面临着如何提高治疗基因的疗效和解决其靶向性表达的问题，而放射性碘对分化型甲状腺癌细胞则具有着高效、特异性的杀伤效果，其摄碘和贮碘的分子基础在于细胞膜上存在着人钠碘转运体( h N I S ) 和人甲状腺过氧化物酶( h T P O ) 。因此，本研究拟构建并应用重组腺病毒作为基因转移载体，将h N I S 和h T P O基因联合转染入胶质瘤细胞，评估转染后细胞的摄碘能力，以及放射性碘在细胞内的代谢动力学变化，并进一步评价放射性碘对胶质瘤细胞的杀伤效果。同时在腺病毒载体中引入人端粒酶逆转录酶( h T E I 玎) 启动子，通过实验分析其靶向性引导h N I S 在胶质瘤细胞中特异性表达的作用。方法1 、使用R T - P C R 和荧光定量P C R 检测多种肿瘤及正常细胞中的h T E R T 表达活性；通过P C R 及p M D 1 8 T 质粒载体对h T E R T 核心启动子进行扩增和克隆；以p G L 3 一B a s i c 为载体构建含h T E R T 启动子和h N I S 基因的重组质粒，并通过荧光素酶活性实验检测h T E R T 启动子在不同细胞中的启动效率2 、应用A d e a s y 系统构建含目的基因的重组腺病毒载体，并对病毒进行滴度测定和转染细胞后表达产物的鉴定。3 、使用重组腺病毒A d h T E R T - h N I S 单独转染，及与A d C M V - h T P O 联合转染胶质瘤细胞U 2 5 1 年1 1 U 8 7 ，确定最适感染复数；进行摄I 实验、晒I 内、外流实验分析放射性碘在胶质瘤细胞内的代谢动力学变化；通过N a C l 0 4 抑制实验和有机化测定实验验证h N I S 和h T P O 的作用；并进行克隆形成实验评估放射性b 1 I 对不同转染组的细胞的杀伤效果。争士申当日木l 、R T - P C R 的结果显示在H 4 6 0 、U 2 5 1 、U 8 7 、A R O 及F R O 等细胞中均存在h T E R Tm R N A 的表达，只是活性的高低不一；而在正常细胞M R C 5 中无表达。荧光定量P C R 的结果显示在胶质瘤细胞U 2 5 1 和U 8 7 内存在h T E R T 的高活性表达，与内参基因1 3 - a c t i n 对照，其相对含量分别为O 1 8 和0 1 2 。天津医科大学博士学位论文2 、成功构建并鉴定了含3 种不同长度h T E R T 启动子序列( 2 6 0b p 、4 5 6b p 及1 4 5 3b p ) 的p M D 1 8 T 和p G L 3 重组质粒，并成功构建并鉴定了含2 6 0b ph T E R T 启动子及h N I S 基因的重组质粒p O L 3 h N I S 。3 、荧光素酶活性实验结果显示，在上述肿瘤细胞中，3 种h T E R T 启动子片段均可诱导荧光蛋白的表达，但其启动效率存在差异，其q b p G L 3 2 0 4 中的启动子片段( 2 6 0b p ) 在F R O 、H 4 6 0 和U 2 5 1 中启动效率最强，可以达至U S V 4 0 启动子的8 0 。4 、构建并纯化了重组腺病毒A d C M V - h T P O ，空斑形成实验测定其滴度约为1 OX1 0 9p f u m l ，感染2 9 3 细胞后行W e s t e r nb l o t 结果显示在11 0k D 处可见阳性反应条带，为表达的h T P O 目的蛋白。5 、摄碘实验结果显示，单独转染组( A d h T E R T - h N I S ) 的胶质瘤细胞U 2 5 1 和U 8 7 均具有了较强的摄碘能力，分别提高了3 0 7 6 倍和2 9 6 6 倍；而联合转染组( A d h T E R T - h N I S A d C M V - h T P O ) 的摄碘能力又均有轻度增高，分别为3 5 5 5倍和3 2 8 8 倍。6 、坨5 I 的内、外流实验显示单独转染组的胶质瘤细胞能够快速的摄碘，峰值均出现在约4 0m i n 时；但碘的流出也较迅速，T e 约为1 1 1 2m i n ；而联合转染组则可以在一定程度上延缓眩5 I 的外流，T e 约为1 8 2 0m i n 。7 、过氯酸盐抑制实验结果显示，不同浓度的N a C l 0 4 均可抑制转染后胶质瘤细胞对1 2 5 I 的摄取，抑制率约为9 3 5 0 9 4 4 8 。有机化测定实验结果显示，联合转染组细胞内与蛋白结合的1 2 5 I 量高于单独转染组，约为后者的3 倍。8 、克隆形成实验结果显示经1 3 1 I 治疗后，联合转染组的克隆形成率降低得最为明显，U 2 5 1 和U 8 7 分别降低了1 1 3 7 和1 4 5 2 倍；其次为单独转染组，分别降低了5 5 2 和6 0 5 倍( P 均 9 0 ) ，而且无需离心设备。为了在纯化过程中获得最佳效果，在实际操作中需要注意以下几点：1 在腺病毒感染宿主细胞4 8 小时内，应在显微镜下监测单层细胞的生长及C P E 情况，至少每天2 次。2 当C P E 效应接近完全，即大多数细胞变圆、肿胀，细胞间的粘附消失，但尚未从培养瓶壁脱落时，收获被感染的2 9 3 细胞。3 当C P E 接近完全时，在反复冻存和解冻之前，大多数病毒仍然位于被感染细胞内。离心后的上清液可以保存在一8 0 温度下备用，否则应立即进行纯化。4 应用纯化滤器过滤过程中，当流速显著减慢时，可柔和的使用注射器活塞以适度增加过滤压。5 注射器和滤器间的气泡可能导致洗脱速度减慢，为避免移液过程中出现气泡，应小心注意避免薄膜滤器破损。当适度加压过滤时，应保持滤液以逐滴滴落的缓慢流速通过滤器。6 在纯化病毒感染靶细胞之前，建议将所需数量的病毒加入5 1 0m l 靶细胞的培养基中，并使用0 2I x m 的消毒滤器过滤。7 为确保较高的病毒回收率，纯化滤器仅能重复使用2 次。否则病毒的感染能力会明显下降。8 再尘溶液虽然可以清除滤器上的病毒或蛋白质，但是为了避免交叉污染，当需要重复使用滤器时，应尽量用于纯化与前次相同的重组腺病毒。2 3 5 腺病毒滴度的不同表述方法及测定在实际研究工作中，有很多概念都用来描述病毒溶液的滴度。如：1 病毒颗粒( V i r a lP a r t i c l e ，V P ) 或光学颗粒单位( O p t i c a lP a r t i c l eU n i t ，O P U ) ；2 基因转移单位( G e n eT r a n s f e rU n i t ，G T U ) 或转导颗粒( T a n s d u c i n gP a r t i c l e ，B l u eF o r m i n gU n i t s ，B F U 即蓝点形成单位，与G T U 类似) ；3 空斑形成单位( P l a q u eF o r m i n gU n i t ，P F U ) ；4 5 0 组织培养感染剂量( ( T i s s u eC u l t u r eI n f e c t i o u sD o s e5 0 ，T C I D s o ) 等。不同的滴度概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法大致包括2 类：物理方法( V P ) 和生物学方法( G T U 、P F U 、T C I D s o ) 。1 测定V P 的方法是测定病毒颗粒在2 6 0 n m 处的吸光度( 病毒D N A 和蛋白的总吸光度中主要为D N A ) ，1 个O D 值相当于1 1 ×1 0 1 2 个病毒颗粒。用这种方7 8天津医科大学博士学位论文二、重组腺病毒载体的构建及其鉴定法进行测定在各个实验室中都较为稳定，粒。因此这种方法只能提供病毒的数量，则没有考虑在内。但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗至于质量，比如是否含有缺陷性颗粒2 G T U 则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将D N A转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如G F P 或B 半乳糖苷酶( 1 3 - g a l a c t o s i d a s e ，L a c Z ) 等则可以用这种方法进行测定。病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。3 P F U 是测定腺病毒滴度最早的标准方法，具体的操作是进行空斑形成实验，主要原理是病毒感染单层培养的2 9 3 细胞后，经过一个感染周期便可再感染邻近的细胞，直至形成一个成熟的空斑，然后通过测定病毒裂解空斑以评估病毒滴度。P F U 是目前最常用的病毒滴度测定方法之一，但也有着重复性不好的弊端。4 T C I D 5 0 己被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞在9 6 孔板进行培养，然后监测每孔是否存在细胞病变效应( C y t o p a t h i cE f f e c t ，C P E ) 1 8 5 J 。T C I D 5 0 方法相对P F U 方法而言具有几个优点，如速度是P F U 的2 倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定等。所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。许多因素如加入的病毒保存液的体积、贮存管的类型、培养的时间、细胞和培养液的数量等都会影响测定结果。其后，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板，另一种方法则在感染时将培养板进行离心，这两个实验方法所得到的结果更为稳定，并证实以前的方法低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数量。但迄今为止，尚无一种方法被控制机构认定为测定滴度的标准方法。对于同一管病毒保存液，不同的方法所得到的结果可能相差1 0 0 倍以上。选择滴定方法要考虑的关键因素包括实用性、稳定性、敏感性、易操作性和消耗的时间。无论选择那种方法，稀释和滴定过程都必须重复操作以得到精确结果。表2 1病毒不同滴度测定方法的特性7 9天津医科大学博士学位论文二、重组腺病毒载体的构建及其鉴定在本研究中，我们使用的仍是传统的空斑法测定重组腺病毒的P F U 滴度，因为目前虽然有了许多滴度测定法，但P F U 仍然是最常用的，也是病毒滴度检测的金标准，其数值大小反映的是具有感染力的病毒颗粒数，即活性病毒数量，因此对指导病毒转染实验中感染复数的测定意义较大。2 3 6W e s t e r nb l o t 检测中融合标签技术的应用对于检测重组腺病毒质粒编码的蛋白质是否为目的蛋白h T P O ，一般可应用W e s t e r n b l o t 的方法予以验证。W e s t e r nB l o t 与S o u t h e r nB l o t 或N o r t h e r nB l o t 的方法类似，但W e s t e r nB l o t 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是目的蛋白质，“探针“ 是特异性的一抗，“显色“ 用酶标记的二抗。经过P A G E 分离的蛋白质样品，转移到固相载体如硝酸纤维素膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的第一抗体起免疫反应，再与辣根过氧化物酶( H o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，H R P ) 标记的第二抗体起反应，经过底物显色或暴光X光胶片上的条