四君子汤防治D—半乳糖所致小鼠脑细胞线粒体损伤机理研究
63页1、广州中医药大学博士学位论文四君子汤防治D半乳糖所致小鼠脑细胞线粒体损伤机理研究姓名:孟辉申请学位级别:博士专业:中医基础理论指导教师:区永欣20060401中文摘要l 选题想路和研究目的随着人口老龄化的日益明显,如何延缓衰老,提高年老者的生活质量,已成为医学界研究的重大课题。近年来,中医药以“肾为先天之本”理论为指导,开展了大量研究工作,阐明了一些中医药抗衰老的机理。然而,衰老是一个多因素综合作用的复杂过程,其中脾作为“后天之本”对衰老过程的影响亦不容忽视。中医学对衰老的认识,早在黄帝内经时代就已有概说。黄帝内经对于人进入一定年龄阶段将必然衰老的原因和衰老发生机制,有较为全面的论述。内经提出:“女子七岁,肾气盛,齿更发长。五七,阳明脉衰,面始焦,发始坠。丈夫八岁,肾气实,发长齿更。八八,则齿发去。肾主水,受五脏六腑之精而藏之,故五脏盛乃能泻。今五脏皆衰,筋骨懈坠,天癸尽矣,故发鬓自,身体重,形步不正,而无子耳。”( 素问上古天真论)“人生十岁,五脏始定血气已通,其气在下,故好走。七十岁,脾气虚,皮肤枯;百岁,五藏皆虚,神气皆去,形骸独居而终矣”。( 灵枢天年) 等观点,明确认为,衰老将
2、随增龄而必然发生,随增龄而自发的脏腑气血的生理病理变化为衰老的内在原因。脾胃虚损与衰老相关的学说源于内经,唐、宋、元、明、清诸医家,均对其有所发展。著名的补土学家李东垣将其重视脾胃的学术思想亦贯入到抗老延年的观点中,日:“凡有此( 脾胃) 病者,虽不易变生他疾,己损天年”,并主张“调理脾胃,老年当先“k 脾胃论) 。李中梓则提出了“先天之本在肾,后天之本在脾”的观点。张介宾日:脾肾“皆为五脏六腑之本”,“土为万物之源,胃气为养生之本是以养生家必以脾胃为先善养脾胃之道,所以便能致寿”( 景岳全书) 。吴昆日:“诸脏腑百骸皆受气于脾胃,而后能强,若脾胃一亏,则众体皆无以受气,日见蔽弱矣”( 医方考) 。龚廷贤日:“凡年老之人,当以养元气,健脾胃为主”( 衰老论) 。王文禄日:“是以养脾者养生之要也。”( 医先) 等等。总之,脾胃受到了普遍性的高度重视,并把这一重视脾胃的思想极大地贯入到抗老延年的理论指导和治法方药之中,并以之与补肾抗衰老相提并论,视之为抗衰老的两大最重要原则。现代研究表明,健脾法可通过不同环节对抗机体的衰老,其延缓衰老作用值得进一步探讨。本课题以健脾益气代表方四君子汤为研究
3、手段,观察其对衰老小鼠模型m t D N A 缺失的影响,以期从基因水平探讨脾与衰老的关系,阐明健脾益气法延缓衰老的分子作用机制。研究结果将丰富中医“脾胃学说”理论的内涵,为延缓衰老提供新的思路和理论依据,并为开发研制抗衰老新药奠定理论基础。2 研究方法21 小鼠衰老模型的建立选用2 月龄昆明种小鼠随机分为6 组:正常对照组,模型对照组,维生素E( 2 5 0 m g k g d “) 组,四君子汤高( 2 0 9 k g d 1 ) 、中( 1 0 9 k g d 1 ) 、低剂量( 5 9 k g d 1 ) 组。D 一半乳糖亚急性衰老模型,水迷宫测试确定学习记忆障碍模型成立。22 观测指标22l 小鼠行为学观测一般状况观察及小鼠学习和记忆能力测试,造模前后各进行一次。222 小鼠脑组织N O 和N O S 含量的测定硝酸还原酶法测定N 0 含量;根据标准品吸光值,计算N O S 活性。2 23 谷光甘肽过氧化物酶( G S H P x ) 活性测定黄嘌呤氧化酶法测定S O D 活性,D T N B显色法测定G S H P x 。2 24 琥珀酸脱氢酶( s u c c i n a
4、 t ed e h y d r o g e n a s e ,S D H ) 比活性测定按试剂盒说明操作。225 小鼠海马组织线粒体D N A 缺失的测定P C R 扩增法。226F u r a 一2 A M 双波长荧光法测定小鼠海马钙浓度荧光分光光度计测定。227 透射电镜样品制各及观察透射电镜观察线粒体形态结构改变并摄片。2 28 脑细胞凋亡的检测方法流式细胞仪检测法。3 实验结果31 一般情况观察模型组小鼠大多数表现为毛发无光或脱落、精神萎靡、进食减少、行动迟缓、活动减少:部分小鼠可出现共济失调、自发运动增多或自我嘶咬等症状。药物治疗组小鼠也可在造模1 个月左右表现为与模型组类似的症状,但症状较轻,且这些症状在2月内逐渐减轻。空白对照组小鼠均未出现上述类似症状。32四君子汤对D 一半乳糖诱致小鼠学习记忆障碍的改善作用D 一半乳糖处理8 周时,模型组小鼠学习和记忆能力明显减弱,表现为学习和记忆阶段的游完全程时间明显延长,进入盲端的错误次数明显增加,与正常对照组小鼠比较具有明显差异( 只0 0 1 ) ,而四君子汤高剂量( S G ) 、中剂量( S Z ) 、低剂量( S D )
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